黄萎病菌毒素在棉花抗病鉴定和遗传分析中的应用研究
开题报告
目 录
一、选题背景
二、研究目的和意义
三、本文研究涉及的主要理论
四、本文研究的主要内容及研究框架
（一）本文研究的主要内容
（二）本文研究框架
五、写作提纲
六、本文研究进展
七、目前已经阅读的文献
一、选题背景
棉花在植物学分类上属于被子植物门、双子叶植物纲、锦葵目、锦葵科、棉属植物，原产地是印度和阿拉伯等亚热带地区。棉花作为世界上最重要的经济作物之一，它既是最重要的纤维作物，又是重要的油料作物，是关系国计民生的重要战略物资。目前，世界上棉花生产量较高的国家主要有中国、美国、印度、巴西、墨西哥、埃及、巴基斯坦、乌兹别克斯坦等。棉花与人民的生活息息相关，对国民经济的健康稳定发展也有着重要影响。但是，被称为“棉花癌症”的棉花黄萎病却严重危害和影响着我国棉花的生产。棉花黄妻病俗称“金边黄”，被称为"棉花癌症”，是一种国际检疫性的土传维管束真菌病害，在我国已遍布各大棉区，也成为我国棉花高产稳产的主要障碍之一（马存等，2003)。棉花黄萎病菌在分类地位上属于半知菌亚门（Deuteromycotina)、淡色孢科(Moliliaceae)、轮枝菌属（Verticillhun)。其寄主主要为双子叶作物，因此很多农作物均为其寄主。棉花黄妻病自1914年首次在美国弗吉尼亚州被发现以来，至今己传播至亚洲、非洲、美洲中的多个植棉国家和地区，全球因黄萎病所造成的经济损失平均每年达10亿多美元（马春红等，2007)。棉花黄萎病具有分布广、危害重、寄主范围宽、传播途径多、存活时间久等特点，且生产上一直未找到理想的控制方法和防治技术。目前，棉花黄萎病已成为制约我国棉花生产实现高产、稳产、优质旳最主要障碍之一（李亚栋等，2011)。但是由于陆地棉中缺乏较好的抗性材料，而且用常规育种方法培育棉花抗黄萎病品种一方面需要的时间较长，另一方面陆地棉中缺乏突出的抗黄萎病材料。因此采用转基因育种技术和常规育种方法相结合，培育并种植抗病品种是当前控制棉花黄萎病经济有效的重要途径。而在培育抗病品种的过程中对候选棉花品系进行蹄选和抗性鉴定是最重要的环节。因此，选用准确、快速、环保的方法对候选棉花品系的抗黄萎病性进行鉴定对培育棉花抗黄萎病品种具有重要的意义。
目前，在棉花成株期对棉花抗黄奏病性的鉴定方法目前主要有自然病圃鉴定以及人工病圃鉴定两种。自然病圃鉴定是指直接利用含有黄萎病菌的棉花田鉴定棉花对黄蒌病的抗性。对用于抗病鉴定的自然病圃要求须发病均匀、菌系具有代表性、发病程度适中、仅含黄萎病一种病害，没有其他病害的干扰等要求。自然病圃多选在棉区的自然病地上，要求病圃能真实反映被鉴定材料抗性强弱。自然病圃鉴定是黄萎病抗性鉴定中最传统也是比较准确的方法，具有简单、经济、效果好等优点，而且抗病鉴定条件较为接近生产实际。但存在病菌分布不均、棉株发病程度不易控制、发病均勾度不高、受外界气候条件影响较大等缺点。人工病圃是通过人工在田间接种黄萎病菌来模拟自然病圃。一般选用地势平坦、土质优良、肥力均勾、排灌方便的田块作为病圃。病圃周围用水泥梗隔离，用以防止病原菌的扩散混杂。一般用棉好、麦粒砂作培养基培养黄萎病菌，于棉花播种或移栽前接入病圃，再通过相应的耕作措施使其均勾分布。当病圃需补充菌量时，可釆用"病杆还田”或“饶灌菌液”等方法。该鉴定方法的优点是接菌较为均勾、可控制病原菌菌量、可控制病原菌的种类、可较好地保证发病程度和发病均勾度等，且鉴定结果较自然病圃法的结果可靠。缺点有易受外界气候条件影响较大，鉴定所需时间较长等。
二、研究目的和意义
目前，防治棉花黄萎病最简单、经济、有效的方法是选育抗病品种。但是，在陆地棉中缺乏抗黄萎病菌突出的抗源材料，所以长期以来在棉花抗黄萎病育种工作中未取得明显的突破，而且用传统育种方法培育抗黄萎病材料需要的周期过长，无法满足生产上的迫切需要。所以采用转基因育种技术和常规育种方法相结合，培育并种植抗病品种是当前控制棉花黄萎病经济有效的重要途径。而在培育抗病品种的过程中对候选棉花品系进行筛选和抗性鉴定是最重要的环节。黄萎病抗性鉴定也是病原菌致病性分化、寄主抗性遗传、抗病机制、抗病种质蹄选、抗病品种选育等研究工作的重要基础。因此，建立一套准确、快速、环保的鉴定方法对于开展棉花抗病育种工作和提高病害综合防治成效等具有重要的理论和实践意义然而，由于棉花黄萎病菌是危害棉花最严重的病菌，又属于被检疫的病菌，所以使用黄萎病菌鉴定棉花对黄萎病抗性受到检疫的限制。本实验中，因为鉴定所用的黄萎病菌毒素为一种糖蛋白，所以有效降低了在抗性鉴定过程中因使用病菌而引起的黄萎病的扩散；并且由于是在室内进行抗性鉴定，所以有效规避了传统鉴定方法因田间病菌分布不均或环境因素的差异而导致的棉花待测品系在田间发病不一致的情况。用毒素代替病原菌作为研究工具，无论在理论上还是在应用上都有及其重要的意义，这不仅是因为它可以消除生物间相互干扰和污染的复杂情况，而且由于方法简便、精确，极易定量等特点，对在分子水平上探讨和深入研宄寄主和病原物间的相互作用有极大的便利（陈旭升，2001)。因此本实验通过探究棉花对黄萎病菌分泌的毒素的反应，检测供试品系的致萎程度，籍以验证毒素鉴定的可行性与可靠性，并在人工病圃内对相应试验材料进行抗病鉴定，对供试棉花品系对黄萎病的抗性进行聚类分析，同时探究棉花对黄萎病的抗性遗传机制，从而为寻找良好的棉花抗黄萎病育种材料并利用黄萎病菌毒素进行棉花抗病鉴定提供理论依据，这也为今后的棉花抗黄萎病育种工作打下坚实的基础。
三、本文研究涉及的主要理论
自上世纪80年代末就有不少学者试图以毒素代替病原菌进行黄萎病抗性鉴定。章元寿用棉花黄萎病菌JV2(X)1毒素检测二叶期棉苗的致萎反应，经对1989-1990年120个棉花品种（系）的室内毒素检测，发现棉苗致萎度与田间病圃鉴定结果之间呈正相关，说明室内毒素鉴定能够反应棉花在田间病圃内的抗、感病程度（章元寿等，1991)。赵明敏等利用痴子黄萎病菌毒素作为选择剂，结合组织培养技术，离体蹄选戒子抗黄萎病突变体，开拓一条体细胞抗病育种的新途径（赵明敏等，2006)。肖松华等利用病圃鉴定和毒素鉴定，分别对35个具有陆地棉遗传背景的野生棉种质渐渗系和抗、感病对照进行抗黄萎病性鉴定，毒素浸根试验结果表明，毒素浸根72h后，供试品种（系）对棉花黄萎病毒素的抗性存在显著差异，根据苗期毒素鉴定的72h致萎度，能够准确预测供试品种（系）成株期在病圃鉴定中对黄萎病的抗性水平（章元寿等，1991；肖松华等，2007)。张兴华的研究结果也证实了室内用毒素检测棉苗的致萎度能反映棉花成株期在田间病圃对于棉花黄萎病的抗性程度（张兴华等，2008)。张慧霞采用毒素针刺叶片法证实了毒素鉴定的可行性（张慧霞等，2008)。吕金殿、张献龙、仇元等也对棉花黄萎病菌毒素做了较多研究，为毒素代替黄萎病菌用于黄萎病抗性鉴定提供了依据。由于棉花黄萎病菌是危害棉花最严重的病菌之一，属于被检疫的病菌，利用接菌鉴定棉花抗病性不仅受到检疫的限制而且还会产生黄萎病菌扩散的风险；而毒素只是一种具有致萎作用的糖蛋白，因此不会产生黄萎病菌扩散的风险。利用毒素鉴定可在室内人工控制条件下，大批量、快速、环保地鉴定出棉花对黄萎病的抗性，是一种快速、经济、有效、绿色的蹄选抗病材料的检测方法。随着分子生物学和生化技术的不断发展，黄萎病菌致萎毒素的研宄也将继续深入，从病原菌致萎毒素的视角了解棉花对黄萎病的抗感机理，将大大拓宽有关棉花黄妻病研究的思路，推动我国棉花抗黄萎病育种技术研究的进程。
棉株在遭受黄萎病菌侵染后，以其内部形成物理障碍或生化障碍或二者同时发生反应的形式来表现其抗性。棉株在遭到病原菌侵袭后首先表现表皮的木质化和内部组织的木栓化。在一定条件下，这种反应可限制一部分病原菌的继续入侵，但不能彻底阻止病原菌旳扩展。在生化障碍方面，棉株在遭受病菌侵袭后，内部产生多种抑菌物质，主要包括棉酌、植保素、单宁等。数年来的研究表明，棉花黄萎病抗性还与一些酶类、氨基酸、激素的含量有关，而且其作用一般不是专化性的。Talboys认为在导管间，类似木质素的物质堆积在细胞壁上以阻止病菌入侵，或堆积在病菌周围形成木质素块将菌丝包围起来；在导管内，以果胶质迅速封闭导管或把纹孔膜扩大成侵填体以阻止分生孢子在木质部扩散。Bell曾报道，棉株木质部导管的发病引起导管堵塞，将入侵病菌限制在维管束系统的一定部位，以阻止病原菌在整个维管束系统生长和繁殖。这些现象普遍发生在耐病品种上(Bell, 1984)。Goicoechea等（2001)指出在受侵染的植株花中的乙炼水平显著升高，说明病原菌增强了植株的增殖能力，这可能是通过调节寄主激素水平的平衡来提高植株的增殖能力的；还有研宄报道，乙稀在棉花黄萎病病株中的含量随着生长素的变化而变化，在抗性棉中乙稀是伴随着生长素剧烈增加的时候开始上升的（徐荣旗等，2000)。
四、本文研究的主要内容及研究框架
（一）本文研究的主要内容
目前，对棉花黄萎病的抗性的鉴定主要还是通过病圃进行鉴定。同时，也有利用黄妻病菌毒素进行抗性鉴定的例子。利用黄赛病菌毒素进行鉴定不仅可以免去使用黄萎病菌设置病圃的步骤从而可以有效降低黄萎病菌传播的风险，而且还可规避检验检疫方面的限制。因此，本实验通过比较多种棉花对黄萎病抗性的鉴定方法，并进行相关性分析，以期找到一个切实可行的对棉花黄萎病进行鉴定的方法。在人工病圃中种植所需鉴定的棉花品系，而后分别在棉花的花蕾期、盛花期和吐絮期来统计各品系的病情指数。通过棉花三个不同生长时期的病情指数，来综合判断各棉花品系对黄萎病的抗性，并对数据进行整理后做聚类分析，以了解各品系对黄萎病的抗性，并验证毒素浸泡叶圆盘法的可行性。目前，棉花对黄萎病的抗性遗传的研宄仍然相对较少，其抗性机制仍有待更加深入的研究。所以本实验利用已有的亲本、Fi、F2以及回交得到的BQ和BC2，使用V02、V97和V02df三个致病力分别为强、中、弱的黄萎病菌毒素，来探索棉花对黄萎病的抗性遗传机制。
（二）本文研究框架
本文研究框架可简单表示为：（略）
五、写作提纲
致谢
摘要
Abstract
缩略词
1 文献综述
1.1 黄萎病菌及其对棉花生长发育的危害
1.2 棉花抗黄萎病的鉴定方法
1.2.1 成株期鉴定棉花抗黄萎病性
1.2.2 苗期鉴定棉花抗黄萎病性
1.2.3 棉花抗黄萎病鉴定的分类方法和病情分级标准
1.3 黄萎病菌毒素研究概况
1.3.1 棉花黄萎病菌毒素的成分
1.3.2 棉花黄萎病菌毒素的提取方法
1.4 黄萎病菌毒素在棉花抗黄萎病鉴定中的应用
1.5 棉花黄萎病抗性遗传和分子生物学研究进展
1.5.1 黄萎病病原菌的致病机制和生理型划分
1.5.2 棉花抗黄萎病机制及抗性遗传
1.5.3 关于抗性基因方面及转基因育种的研究
1.6 本研究的内容、目的及意义
1.6.1 本研究的内容
1.6.2 本研究的目的和意义
2 一种新的鉴定棉花抗黄萎病性方法——毒素浸泡叶圆盘法
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 试验材料
2.2.2 试验方法
2.3 结果与分析
2.3.1 棉花叶圆盘浸泡黄萎病菌毒素后的反应
2.3.2 黄萎病菌毒素浓度对棉株抗性鉴定的影响
2.3.3 叶圆盘所处叶位和生育时期对棉株抗性鉴定的影响
2.3.4 与田间成株期人工病圃鉴定结果的比较分析
2.4 讨论
3 用病菌毒素联合鉴定棉花对黄萎病的抗性
3.1 引言
3.2 材料和方法
3.2.1 实验材料
3.2.2 实验方法
3.2.3 数据处理
3.3 结果与分析
3.3.1 不同鉴定方法的比较
3.3.2 使用毒素浸根法时毒素浓度对棉株抗性鉴定的影响
3.3.3 使用毒素浸泡叶圆盘法时毒素浓度和取样时期的选择
3.3.4 黄萎病菌毒素处理和孢子悬浮液处理在致病时间上的差异
3.3.5 联用毒素浸根法与毒素浸泡圆叶片法在鉴定棉花对黄萎病抗性上的应用
3.4 讨论
4 不同棉花品系对黄萎病抗性的聚类分析
4.1 引言
4.2 材料和方法
4.2.1 实验材料
4.2.2 实验方法
4.3 结果与分析
4.3.1 不同年份待测棉花品系抗黄萎病性频数的分布
4.3.2 2013年常规病圃法的聚类分析
4.3.3 2013年毒素浸泡叶圆盘法聚类分析
4.3.4 2014年常规病圃法聚类分析
4.3.5 2014年毒素浸泡叶圆盘法聚类分析
4.4 讨论
5 棉花黄萎病抗性的遗传分析
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 实验材料
5.2.2 实验方法
5.3 结果与分析
5.3.1 不同黄萎病菌菌株浸根下各组合F_2群体AUDPC的分布
5.3.2 棉花抗黄萎病性遗传方式
5.3.3 棉花抗黄萎病性的遗传效应
5.3.4 不同时间段棉花对黄萎病的抗性遗传效应
5.4 讨论
参考文献
六、本文研究进展(略)
七、目前已经阅读的主要文献
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