【摘要】 目的 研究不同浓度rhBMP-2在不同时间对兔下颌骨牵引成骨区新骨生成的影响及牵引区新骨中骨保护素（osteoprotegerin，OPG）的表达。方法 在48只成年大耳白兔的一侧下颌骨前部行骨切开术，分别将空白胶原、rhBMP-2 1.5 mg和rhBMP-2 3 mg胶原复合物植入下颌骨切开处，用牵引器延长一侧下颌骨4 mm，稳定期第1、3、7、14天，分别处死各组动物，取牵引区新生骨痂行OPG免疫组化染色。结果 下颌牵引延长后牵引间隙均有新骨形成，免疫组化染色OPG主要定位于成骨细胞的胞浆中。在同一时间内，应用rhBMP-2组较对照组有显著性差异(P＜0.05)，且rhBMP-2 3 mg剂量组较rhBMP-2 1.5 mg剂量组有显著性差异(P＜0.05)。结论 动物实验表明，rhBMP-2能促进兔下颌骨牵引成骨区新骨的生成并具有浓度依赖性。
【关键词】 牵引成骨 rhBMP-2 骨保护素
Abstract：Objective To investigate the Effects of different concentrations of rhBMP-2 on mandibular distraction osteogenesis and the expression of OPG in the period of distraction osteogenesis. Methods Unilateral mandibular osteotomies were performed in 48 mature rabbit， 1.5 mg rhBMP-2 or 3 mg rhBMP-2 with the collagen carrier were implanted in the osteotomy side of mandibles.Only collagen sponge was implanted in control group.the mandibles of 48 rabbits were lengthened by 4 mm using a distractor ， The animals were killed on 1，3，7，14 days of consolidation period. The distracted calluses were harvested and processed for immunohistochemistry study of OPG. Results The regenerated bone was found in the distraction gap after mandibular lengthening. Staining of OPG was localized in osteoblasts cell of the periosteal region after completion of distraction. The mandibular side treated with 1.5 mg rhBMP-2 gained greater amount of new bone formation than treated with collagen sponge，and the mandibular side treated with 3 mg rhBMP-2 harvested greater amount of new bone formation than treated with 1.5 mg rhBMP-2. OPG expression was found in the cytoplasm of osteoblasts and stained brown or dark brown by immunohistochemistry. In the mean time，OPG expression indicated there was siganificant difference between rhBMP-2 group and control group(P＜0.05)，and 3 mg rhBMP-2 group had siganificant difference comparing with 1.5 mg rhBMP-2 group (P＜0.05). Conclusions The animal experiment shows rhBMP-2 could accelerate bone formation of mandibular distraction osteogenesis in rabbit and was concentration-dependent.rhBMP-2 could increase the expression of OPG.
Key words：mandibular osteo-distraction；recombinant human morphogenetic protein2；osteoprotegerin
牵引成骨（distraction osteogenesis，DO）近年来已成为矫治颅颌面先天和后天性骨骼发育不足及整复颌骨缺损的一个重要手段。目前，如何应用外源性生长因子来加速牵引后新骨愈合，缩短牵引成骨时间，是这一技术中的研究热点。本研究旨在通过兔下颌骨DO实验动物模型，研究不同剂量rhBMP-2对兔下颌骨牵引成骨区新骨生成的影响及其骨保护素(osteoproterin，OPG)的表达，探索rhBMP-2促进牵引成骨区新骨生成的机制、rhBMP-2的最佳有效剂量及兔下颌骨DO中加入外源性rhBMP-2对牵引成骨区新骨生成的作用，以缩短DO疗程、减少并发症和减轻患者痛苦，为临床应用提供依据。
１ 材料与方法
1.1 材料
兔下颌骨牵引器（西安中邦公司加工制作）日本大耳白兔48只（辽宁医学院实验动物中心提供）。ABC免疫组化试剂盒和OPG多克隆抗体均购自武汉博士德试剂公司。
1.2 实验方法
选健康成年大耳白兔48只，体重3.0～3.5 kg，随机分3组，每组16只，选取一侧下颌骨为实验侧，另一侧为对照组（Control group）。全麻平稳后于兔下颌骨下缘行水平切口，分离组织显露下颌骨。下颌骨截断后安置牵引器，骨膜下植入不含rhBMP-2胶原海绵载体；第一实验组（Group 1）下颌骨截断后安置牵引器，牵引区骨膜下植入含1.5 mg rhBMP-2的胶原海绵载体；第二实验组（Group 2）下颌骨截断后安置牵引器，牵引区骨膜下植入含3 mg rhBMP-2的胶原海绵载体。经过5 d的间歇期后，以0.8 mm/d，0.4 mm/次的牵引速度牵引，每次间隔12 h，向前缓慢延长下颌骨，连续牵引5 d，即延长下颌骨4 mm后固定牵引器。
1.3 标本获取与处理
在牵引结束后的第1、3、7、14天后分别处死各组所有动物，取牵引处下颌骨骨痂入4 %多聚甲醛溶液中固定24 h，EDTA脱钙后，乙醇逐级脱水，石蜡包埋，作5 μm厚连续切片。
1.4 免疫组化染色与分析
将切片用免疫组化ABC法检测单侧下颌牵引区新生骨组织中的OPG的表达。以1∶100的OPG抗体工作浓度进行免疫组化染色，以PBS代替一抗作阴性对照，胞浆棕色颗粒为这种细胞因子OPG的阳性信号。
1.5 统计方法
用SPSS软件，采用多重比较的方差分析。
2 结 果
所有实验动物的一侧下颌骨均被成功延长，处死动物时见牵引间隙有新生骨痂形成。
稳定期第1天：对照组OPG在成骨样细胞及其前体细胞中呈阳性染色（图1）；Group 1组OPG在增殖活跃的成骨样细胞胞浆中呈阳性染色（图2）；Group 2组OPG在大量明显沿牵引方向排列的成骨样细胞胞浆中呈阳性染色（图3）。
稳定期第3天：3组中OPG在成骨样细胞及其前体细胞的胞浆中均有表达，其中Group 2组表达的较多。
稳定期第7天：对照组、Group 1组和Group 2组少量骨小梁表面附着的成骨细胞可见OPG阳性着色，在Group 2组骨小梁周围的纤维结缔组织间质内也有少许着色。
稳定期第14天：对照组在增多的骨小梁周边的成骨细胞胞浆内染色，Group 1组围绕骨小梁周边的成骨细胞内少许OPG染色，Group 2组在较成熟的骨小梁周围骨基质出现阳性表达染色很弱。表1 各组牵引区表达OPG的阳性细胞率（略）注：* 表示在同一时间内，该组与对照组比较有显著性差异（P＜0.05），**表示该组与对照组比较有高度显著性差异（P＜0.01）；▲ 表示该组与Group 1比较有显著性差异（P＜0.05）
表中数据经方差分析结果表明，在同一时间内，随着rhBMP-2剂量的增加，牵引区表达OPG阳性细胞率逐渐增多。Group 1组阳性细胞率增多与对照组有显著性差异(P＜0.05)，Group 2组阳性细胞率进一步增多与对照组有高度显著性差异(P＜0.01)且Group 2组阳性细胞率与Group 1组有显著性差异(P＜0.05)；在同一剂量下，随着时间的延长阳性率逐渐下降。稳定期第1天阳性细胞率与稳定期第3天有显著性差异(P＜0.05)；稳定期第3天阳性细胞率减少，高于稳定期第7天（P＜0.05)；稳定期第7天阳性细胞率进一步减少，高于稳定期第14天(P＜0.05)。
3 讨论
尽管DO已在矫治颅面骨发育不全和唇腭裂术后继发畸形等方面显示出独特的优势［1-3］，但其较长的疗程及其并发症是目前限制该技术在临床进一步应用的重要因素。目前，国内外学者正致力于探索各种方法和措施促进牵引后新骨生成和改建，以期达到缩短疗程和获取高质量牵引成骨效果的目的。
正常的骨折愈合过程依赖于骨吸收和骨形成过程的动态平衡，而这一过程又分别与破骨细胞(osteoclast，OC)和成骨细胞(osteoblast，OB)的功能密切相关，OPG能显著抑制OC的分化、增殖和骨吸收功能［4］。BMP-2的成骨作用已被大量的研究证实，在DO早期，BMP-2主要是能促进OB前体细胞向成熟OB转化，而且可显著促进成骨细胞系中OPG的表达。DO的成骨过程和骨折愈合有相似之处。Tamiyo K［4-6］44-51等人用原位杂交方法在对鼠骨折后骨折愈合过程中OPG表达的研究发现，在骨折第1天和软骨形成的第7天OPG表达明显增高，而第1天表达最高，第3天迅速下降，第7天又增高，后又逐渐下降，第28天仅有微弱表达，而在DO中OPG表达的研究相对较少。国内祝为桥在实验中发现，大鼠下颌骨牵引后牵引区新骨的OPG和RANKL在牵引早期表达明显，随时间的推移表达逐渐下降。以上研究提示OPG可能在骨折愈合和DO早期促进牵引区新骨生成扮演重要作用，为OPG在骨折愈合和DO的研究奠定了基础。在本研究中我们采用免疫组化方法观察到，在稳定期的不同时期，牵引区新骨生成处的OB和骨髓SC中均存在OPG的表达。在稳定期第1、3天，主要表达在增殖活跃的成骨细胞及其前体细胞等骨髓基质细胞中，在稳定期第7天；主要表达于沿牵引方向排列的成骨细胞和成纤维细胞中；在稳定期第14天，主要表达在排列于骨小梁周围的OB中，而在成熟的骨细胞中表达较少。
牵引成骨是一个复杂而特殊的骨再生过程，本实验通过兔下颌DO动物模型研究，结果显示局部应用外源性rhBMP-2可以促进牵引区新骨生成，具有加快新骨生成和钙化的作用，但具有剂量依赖性。从而为缩短DO疗程和减少并发症提供了一种可能的途径，为治疗一些骨科疾病打下理论基础。
参考文献
［1］Min H，Morony S，Sarosi I，et al.Osteoprotegerin reverses osteoporosis by inhibiting endosteal osteoclasts and prevents vascular calcification by blocking a process resembling osteoclastogenesis［J］.J Exp Med，2000，192：463-474.
［2］Kanzaki H，Chiba M，Shimizu Y，et al.periodontal ligament cells under mechanical stress regulation via rostaglandin E2 synthesis［J］.J Bone MIner Res，2002，17(2):210-220.
［3］Oshiro at，shiotani A，shibasaki Y，et al.Permental movement of incisirs in osteoprotegerin-deficient mice［J］.Anat Rec 2002，266(4)：218-225.
［4］Hasegawa T，Kikuiri T，Takeyama S，et al.Human periodontal ligament cells derived from decidous teeth induce osteoclastogenesis in vitro ［J］.Tissue Cell，2002，34(1)：44-51.
［5］Hofbauer LC，Dunstan CR，Spelsberg TC，et al.osteoprotegerin production by human osteoblast lineage cells in stimulated by bitamin D，bone morphogenetic protein-2，and cytokines［J］.Biochem Biophys Res Commun，1998，250：776-781.
［6］Takai H，Kane matsu M，Yano K，et al.Transforming growth factor-beta stimulates the production of osteoprotegerin／osteoclastogenesis inhibitory factor by bone marrow stromal cells［J］.J Biol Chem，1998，273：27091-27096.