作者：邹勇芳，苏玉凤，李清容，黄锁义，潘乔丹
【摘要】 目的 用水提醇沉法从木菠萝粉末中提取木菠萝多糖。方法 Sevage法脱蛋白，用硫酸—苯酚法测定木菠萝多糖含量。测定波长为495nm，正交试验设计选择得到木菠萝多糖的最佳显色条件。结果 在10～60μg/ml 范围内吸光度与被测物含量呈良好的线性关系，r=0.9999。测得多糖含量为5.53％，稳定性RSD=2.26％，回收率为102.16％。结论 该方法简便、快速、准确、灵敏度高。
【关键词】 木菠萝 多糖类 苯酚—硫酸法
木菠萝又称“菠萝蜜”、“树菠萝”(Artocapus heterophyllus.Lam)，属桑科乔木树种，原产于印度和马来西亚，有“ 热带水果之王”美称［1，2］。木菠萝果肉爽脆，蜜甜，含有丰富的糖、蛋白质和微量元素，成熟果芳香味浓，香气独特，肉色橙黄鲜艳，营养价值很高［1］，研究表明木菠萝多糖在医药、食品方面均有很好的应用前景和开发价值［1］。木菠萝叶合剂，具有清热解毒、防腐止痒、杀菌收敛的作用，对山羊传染性脓疱口膜炎，对马、牛、猪、羊、犬的湿疹，都有很明显治疗效果［3］。而有关木菠萝多糖方面的研究较少，目前测定木菠萝多糖含量的方法未见报道，鉴于木菠萝多糖所具有的增强免疫力、抗肿瘤、抗病毒以及抗衰老等特殊生物活性，对木菠萝这一名贵植物的多糖类物质有待于进一步开发与利用。因此，笔者采取苯酚—硫酸法对木菠萝多糖含量进行测定，为木菠萝新药和食品的开发奠定基础，以期为进一步开发利用木菠萝多糖提供科学依据。
1 仪器与试剂
UV-755B型紫外可见分光光度计：上海分析仪器总厂；电子天平:上海精科天平；电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。
木菠萝为广西百色市右江区木菠萝湿包类型的干燥成熟果实；葡萄糖对照品：上海化学试剂有限公司；95％乙醇、浓硫酸、苯酚、三氯甲烷、正丁醇、石油醚、丙酮、乙醚等其他试剂均为分析纯。
2 实验方法
2.1 木菠萝多糖提取工艺［4］
木菠萝去核、取湿包于60℃下真空干燥，称取干燥的木菠萝约12.0g，粉碎后，用热水浸提，抽滤，合并滤液并进行减压浓缩。在浓缩液中加入2倍体积的石油醚脱脂2次，滤出溶剂，残渣风干，以80%乙醇回流2次，每次3h。回收乙醇，将浓缩液置于250ml三角瓶中，加入浓缩液5倍体积的氯仿—正丁醇［V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1］混合液，振摇10min，在4 000r/min离心10min，分离除去沉淀，以上步骤重复5次以除去游离蛋白质。上清液以5倍体积95%乙醇沉淀2次，抽滤，固形物依次以丙酮、乙醚、无水乙醇洗涤，得木菠萝粗多糖置真空干燥，备用。
2.2 苯酚溶液的配制
称取苯酚100g，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，常压蒸馏，收集182℃馏分，精密称取该馏分15.00g，置于250ml棕色容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度(6％苯酚溶液)，摇匀，放入冰箱中备用。
2.3 葡萄糖标准溶液的配制
精密称取105℃烘干至恒质量的葡萄糖100mg，加蒸馏水溶解，定容至100ml，得到浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液。
2.4 最大吸收波长的选择［5］
精密量取1mg/ml葡萄糖标准溶液0.2ml置于10ml具塞试管中，加入6％苯酚1.4ml，迅速加入浓硫酸7.0ml，混匀，放置5min，置沸水浴中加热15min，取出后置冷水中冷却15min。并用蒸馏水配成20ml溶液，以蒸馏水为空白对照，于380～600nm波长范围内测定吸收度，测得葡萄糖的最大吸收波长为495nm。
2.5 正交法选择显色条件［5］
以显色剂6％苯酚用量、硫酸用量及反应时间为参考因素，每个因素各取3个水平，按L9(33)正交设计法确定最佳的显色条件，因素与水平见表1。表1 L9(33)正交实验因素水平（略）
2.6 标准曲线的绘制［5］
精密吸取1mg/ml标准葡萄糖溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml，在最大吸收波长下用2.4所述方法测定各组溶液的吸光度A，以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并进行回归处理。
2.7 换算因子的测定
精确称取干燥恒重的木菠萝多糖10.0mg，定容于50ml容量瓶，精密吸取一定量的提取液稀释一定倍数后按2.4所述方法精密吸取此溶液置于20ml具塞试管中，测定吸光度，并按下式计算换算因子。
换算因子f=m/C
式中：m为称取多糖的质量（mg），C为多糖液中葡萄糖的含量（mg/ml）。
2.8 样品中木菠萝多糖含量的测定
2.8.1 样品溶液的制备
精密称取干燥的木菠萝粉末6.00g，加水80 ml，800C水浴提取1.5h，过滤，合并两次滤液，浓缩，冷冻干燥，得棕红色木菠萝水提物样品固型物5.15g。加体积分数80％乙醇50ml，于80℃回流提取0.5h，趁热过滤，重复3次，得滤渣，加丙酮—石油醚(体积比1∶1)混合液50ml脱色0.5h，过滤，滤渣烘干，得灰白色样品粉末0.3320g，精确称取灰白粉末20.0mg，加水定容至50ml，得样品溶液。
2.8.2 样品溶液中木菠萝多糖的含量测定
精密吸取一定量的2.8.1所得的样品溶液直于20ml具塞试管中，按照2.4的方法测定吸光度，由回归方程计算供试液中葡萄糖含量，按下式计算样品中多糖的含量。
多糖含量=Cf/m
式中：C为样品溶液中葡萄糖的含量(mg/ml)，f为换算因子，m为样品质量(mg)。
2.9 稳定性实验
取木菠萝样品溶液适量，按2.4所述方法分别于0、30min、60min、90min、120min、150min、180min测定吸光度。
2.10 精密度实验
取上述样品进行6次测定，计算相对偏差，考察该方法的重现性。
3 结果与讨论
3.1 多糖提取结果
木菠萝多糖为棕黄色粉末，易溶于水，难溶于高浓度的乙醇、乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂。与斐林(Fehling)试剂作用呈红色，与硫酸-苯酚试剂作用显棕红色反应，均表明产品中含有葡萄糖。在190～400nm进行紫外扫描在280nm处无吸收峰，表明多糖中不含蛋白质。
3.2 显色条件选择
硫酸—苯酚法测定木菠萝多糖含量时的显色条件测定结果，见表2。从表2中R值的大小可以确定各因素对显色反应的影响按大小次序来说应当是浓硫酸浓度&>苯酚浓度&>反应时间，最优显色条件为6％苯酚用量1.4ml、98%浓硫酸用量7.0ml、反应时间15min。
3.3 标准曲线
吸光度A对葡萄糖的含量C回归，得回归方程A=12.9743C+0.0364，r=0.9999(n=5)，表明在10～60μg/ml范围内葡萄糖的含量与吸光度呈良好的线性关系，见表3。
3.5 木菠萝干粉中多糖含量的测定结果
测得的吸光度代入回归方程算出木菠萝干粉中葡萄糖的含量，其含量为5.53%。表2 正交实验结果分析（略）表3 分光光度法测定葡萄糖对照液吸光度（略）
3.4 换算因子的测定结果
f=0.9569
3.6 稳定性实验结果
实验结果（见表4）表明，样品溶液在显色3h内，吸光度A值无明显变化，显色稳定，RSD=2.26%。表4 稳定性实验结果（略）
3.7 回收实验
精密吸取精制的木菠萝多糖溶液5份，测定其加样回收率，结果平均回收率为102.16%，RSD=2.08%。
4 结论
通过水提醇沉法从木菠萝干粉中提取了多糖，Sevage法除蛋白得到灰白色粉末状木菠萝多糖，用硫酸-苯酚比色法测定木菠萝干粉中多糖含量，最大吸收波长为495nm，最佳显色条件为:6％苯酚用量1.4ml、98％浓硫酸用量7.0ml、反应时间15min。多糖浓度在10～60μg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系，测得木菠萝干粉中多糖含量为5.53％。该法显色稳定、重现性好。对分析木菠萝的有效成分含量以及测定方法提供了实验依据，对进一步挖掘木菠萝的临床价值具有重要意义。
参考文献
木菠萝又称“菠萝蜜”、“树菠萝”(Artocapus heterophyllus.Lam)，属桑科乔木树种，原产于印度和马来西亚，有“ 热带水果之王”美称［1，2］。木菠萝果肉爽脆，蜜甜，含有丰富的糖、蛋白质和微量元素，成熟果芳香味浓，香气独特，肉色橙黄鲜艳，营养价值很高［1］，研究表明木菠萝多糖在医药、食品方面均有很好的应用前景和开发价值［1］。木菠萝叶合剂，具有清热解毒、防腐止痒、杀菌收敛的作用，对山羊传染性脓疱口膜炎，对马、牛、猪、羊、犬的湿疹，都有很明显治疗效果［3］。而有关木菠萝多糖方面的研究较少，目前测定木菠萝多糖含量的方法未见报道，鉴于木菠萝多糖所具有的增强免疫力、抗肿瘤、抗病毒以及抗衰老等特殊生物活性，对木菠萝这一名贵植物的多糖类物质有待于进一步开发与利用。因此，笔者采取苯酚—硫酸法对木菠萝多糖含量进行测定，为木菠萝新药和食品的开发奠定基础，以期为进一步开发利用木菠萝多糖提供科学依据。
1 仪器与试剂
UV-755B型紫外可见分光光度计：上海分析仪器总厂；电子天平:上海精科天平；电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。
木菠萝为广西百色市右江区木菠萝湿包类型的干燥成熟果实；葡萄糖对照品：上海化学试剂有限公司；95％乙醇、浓硫酸、苯酚、三氯甲烷、正丁醇、石油醚、丙酮、乙醚等其他试剂均为分析纯。
2 实验方法
2.1 木菠萝多糖提取工艺［4］
木菠萝去核、取湿包于60℃下真空干燥，称取干燥的木菠萝约12.0g，粉碎后，用热水浸提，抽滤，合并滤液并进行减压浓缩。在浓缩液中加入2倍体积的石油醚脱脂2次，滤出溶剂，残渣风干，以80%乙醇回流2次，每次3h。回收乙醇，将浓缩液置于250ml三角瓶中，加入浓缩液5倍体积的氯仿—正丁醇［V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1］混合液，振摇10min，在4 000r/min离心10min，分离除去沉淀，以上步骤重复5次以除去游离蛋白质。上清液以5倍体积95%乙醇沉淀2次，抽滤，固形物依次以丙酮、乙醚、无水乙醇洗涤，得木菠萝粗多糖置真空干燥，备用。
2.2 苯酚溶液的配制
称取苯酚100g，加铝片0.1g和碳酸氢钠0.05g，常压蒸馏，收集182℃馏分，精密称取该馏分15.00g，置于250ml棕色容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度(6％苯酚溶液)，摇匀，放入冰箱中备用。
2.3 葡萄糖标准溶液的配制
精密称取105℃烘干至恒质量的葡萄糖100mg，加蒸馏水溶解，定容至100ml，得到浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液。
2.4 最大吸收波长的选择［5］
精密量取1mg/ml葡萄糖标准溶液0.2ml置于10ml具塞试管中，加入6％苯酚1.4ml，迅速加入浓硫酸7.0ml，混匀，放置5min，置沸水浴中加热15min，取出后置冷水中冷却15min。并用蒸馏水配成20ml溶液，以蒸馏水为空白对照，于380～600nm波长范围内测定吸收度，测得葡萄糖的最大吸收波长为495nm。
2.5 正交法选择显色条件［5］
以显色剂6％苯酚用量、硫酸用量及反应时间为参考因素，每个因素各取3个水平，按L9(33)正交设计法确定最佳的显色条件，因素与水平见表1。表1 L9(33)正交实验因素水平（略）
2.6 标准曲线的绘制［5］
精密吸取1mg/ml标准葡萄糖溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml，在最大吸收波长下用2.4所述方法测定各组溶液的吸光度A，以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并进行回归处理。
2.7 换算因子的测定
精确称取干燥恒重的木菠萝多糖10.0mg，定容于50ml容量瓶，精密吸取一定量的提取液稀释一定倍数后按2.4所述方法精密吸取此溶液置于20ml具塞试管中，测定吸光度，并按下式计算换算因子。
换算因子f=m/C
式中：m为称取多糖的质量（mg），C为多糖液中葡萄糖的含量（mg/ml）。
2.8 样品中木菠萝多糖含量的测定
2.8.1 样品溶液的制备
精密称取干燥的木菠萝粉末6.00g，加水80 ml，800C水浴提取1.5h，过滤，合并两次滤液，浓缩，冷冻干燥，得棕红色木菠萝水提物样品固型物5.15g。加体积分数80％乙醇50ml，于80℃回流提取0.5h，趁热过滤，重复3次，得滤渣，加丙酮—石油醚(体积比1∶1)混合液50ml脱色0.5h，过滤，滤渣烘干，得灰白色样品粉末0.3320g，精确称取灰白粉末20.0mg，加水定容至50ml，得样品溶液。
2.8.2 样品溶液中木菠萝多糖的含量测定
精密吸取一定量的2.8.1所得的样品溶液直于20ml具塞试管中，按照2.4的方法测定吸光度，由回归方程计算供试液中葡萄糖含量，按下式计算样品中多糖的含量。
多糖含量=Cf/m
式中：C为样品溶液中葡萄糖的含量(mg/ml)，f为换算因子，m为样品质量(mg)。
2.9 稳定性实验
取木菠萝样品溶液适量，按2.4所述方法分别于0、30min、60min、90min、120min、150min、180min测定吸光度。
2.10 精密度实验
取上述样品进行6次测定，计算相对偏差，考察该方法的重现性。
3 结果与讨论
3.1 多糖提取结果
木菠萝多糖为棕黄色粉末，易溶于水，难溶于高浓度的乙醇、乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂。与斐林(Fehling)试剂作用呈红色，与硫酸-苯酚试剂作用显棕红色反应，均表明产品中含有葡萄糖。在190～400nm进行紫外扫描在280nm处无吸收峰，表明多糖中不含蛋白质。
3.2 显色条件选择
硫酸—苯酚法测定木菠萝多糖含量时的显色条件测定结果，见表2。从表2中R值的大小可以确定各因素对显色反应的影响按大小次序来说应当是浓硫酸浓度&>苯酚浓度&>反应时间，最优显色条件为6％苯酚用量1.4ml、98%浓硫酸用量7.0ml、反应时间15min。
3.3 标准曲线
吸光度A对葡萄糖的含量C回归，得回归方程A=12.9743C+0.0364，r=0.9999(n=5)，表明在10～60μg/ml范围内葡萄糖的含量与吸光度呈良好的线性关系，见表3。
3.5 木菠萝干粉中多糖含量的测定结果
测得的吸光度代入回归方程算出木菠萝干粉中葡萄糖的含量，其含量为5.53%。表2 正交实验结果分析（略）表3 分光光度法测定葡萄糖对照液吸光度（略）
3.4 换算因子的测定结果
f=0.9569
3.6 稳定性实验结果
实验结果（见表4）表明，样品溶液在显色3h内，吸光度A值无明显变化，显色稳定，RSD=2.26%。表4 稳定性实验结果（略）
3.7 回收实验
精密吸取精制的木菠萝多糖溶液5份，测定其加样回收率，结果平均回收率为102.16%，RSD=2.08%。
4 结论
通过水提醇沉法从木菠萝干粉中提取了多糖，Sevage法除蛋白得到灰白色粉末状木菠萝多糖，用硫酸-苯酚比色法测定木菠萝干粉中多糖含量，最大吸收波长为495nm，最佳显色条件为:6％苯酚用量1.4ml、98％浓硫酸用量7.0ml、反应时间15min。多糖浓度在10～60μg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系，测得木菠萝干粉中多糖含量为5.53％。该法显色稳定、重现性好。对分析木菠萝的有效成分含量以及测定方法提供了实验依据，对进一步挖掘木菠萝的临床价值具有重要意义。