【摘要】 目的 探讨骨骼肌源性干细胞体外培养、鉴定的方法。方法 采用I型胶原酶和胰蛋白酶两步消化法分离大鼠骨骼肌源性干细胞，经差速贴壁法纯化后，培养液中培养。倒置显微镜观察细胞形态，生长曲线分析肌源性干细胞的增殖能力，结蛋白细胞免疫荧光方法鉴定肌源性干细胞。结果 经过两步消化和差速贴壁后， 成功培养出高纯度的肌源性干细胞，细胞免疫荧光结果为desmin(+)。结论 通过体外原代培养获得高纯度肌源性干细胞，结蛋白细胞免疫荧光可以对其早期鉴定，为组织工程的临床应用提供种子细胞。
【关键词】 大鼠 肌源性干细胞 体外培养
Abstract：Objective To establish the methods for culture and identification of rat muscle-derived stem cells in vitro.Methods By two-step method， the rat muscle was digested with type I collagen and trypsin， and the isolated cell suspension was purified by different adhesion time . The proliferation ability of muscle-derived stem cells was analysed through studying growth curve， and the obtained cells were identified with cell immunofluroescence technique．Results Highly purified MDSCs were harvested and they showed desmin(+) by cell immunofluroescence technique．Conclusions MDSCs can be cultured in vitro and can be identified by desmin stain and used to tissue engineering as “seed”cells.
Key words：rat ; muscle derived stem cells ; culture in vitro
近年研究发现，成体骨骼肌中不但存在单能的成肌干细胞－卫星细胞，而且还含有多能的“肌源性干细胞”（muscle derived stem cells，MDSCs）。肌源性干细胞起源于胚胎血管祖细胞，在适当的微环境中，可分化为血细胞、成骨细胞、神经细胞等不同胚层的组织细胞，MDSCs的表面标志已被初步认识，对其分化的研究，及其分离纯化的技术研究正在进一步深入 ［1-3］。本实验经过技术改良，通过体外原代培养获得高纯度MDSCs，为组织工程的临床应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 I型胶原酶(Sigma)， 0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，胎牛血清(Gibco)，高糖DMEM培养基(Gibco)，D-Hank’ s(Gibco)，青霉素及链霉素(国产)。小鼠抗大鼠Desmin一抗、羊抗小鼠FITC（异硫氰酸荧光黄）(武汉博士德)。
1.2 原代MDSCs的取材、分离纯化 参照
参考文献
所报道的方法［4，5］ ，选用新生3～5 d的S－D乳鼠5只；浸入75%的医用酒精中，5 min×3次，处死并消毒；无菌条件下取前肢肱三头肌，后肢腓肠肌，尽可能剔除脂肪、肌腱等结缔组织：用PBS液漂洗2次，将肌组织移入一小平皿，用眼科剪剪成乳糜状；加入1%的Ⅰ型胶原酶3 mL，37 ℃消化30 min；加入0.25%的胰酶3 mL，37 ℃消化45 min；加入5倍体积的胎牛血清中止消化，反复吹打后滤过200目的筛网，收集滤液，1 000 r/ min离心7 min，室温静置5 min弃上层液，细胞团块用生长培养基(含20%胎牛血清的DMEM)重悬，移入培养瓶中，该培养瓶称为PP1。PP1于37 ℃ 、含5%CO2的细胞培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶中培养，此为PP2。此后连续4 d每隔24 h将悬液离心、重悬后转移至新的培养瓶中，分别为PP3～PP6。PP1～PP5弃去不用，PP6用于进一步的鉴定实验，细胞在达到约70%汇合时必须传代。1.3 MDSCs生长曲线的绘制 取PP6传至第2代细胞，0.25%胰蛋白酶消化，以3.0×104个／孔接种于24孔培养板。每日取3孔消化后，进行细胞记数，共7日根据记数结果绘制细胞生长曲线。
2008年2月，29(1)1.4 MDSCs的免疫荧光鉴定 取PP6中的MDSCs培养到第3代时，把细胞培养在6孔板中的盖玻片上，第5 d细胞生长达70%～80%汇合，用75%乙醇固定30 min，PBS洗5 min，2次；加入5%BSA封闭液，常温下静置1 h，封闭非特异性结合，不清洗。滴加小鼠抗大鼠Desmin一抗，37 ℃孵育2 h；PBS洗5 min，3次；滴加羊抗小鼠FITC，避光孵育30 min；PBS洗5 min，3次；50%缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察，照相。
2 结 果
2.1 分离细胞的形态、生长特性 PP1、PP2（图1A）贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞，其余是宽大而呈星形或不规则的杂细胞，增殖较快，1周左右即可完全融合。PP3（图1B）开始即有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少。随着纯化的继续，圆形或短梭形细胞的数量明显增加，到PP6（图1C）时超过80%，这些细胞贴壁后绝大多数为梭形或纺锤形， 有两极， 体积小， 胞核折光性强。少数细胞呈多角形， 有突起。随培养时间延长，细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，若不加以控制及时传代，细胞可迅速融合成细胞链或聚成团块生长，细胞增殖速度减慢， 细胞相互融合， 形成肌小管（图1D）。图1A PP1、PP2贴壁细胞相对较少，大部分是长梭形的成纤维样细胞和宽大而呈星形或不规则的杂细胞×200
图1B PP3有少量的短梭形、圆形或多角形细胞贴壁，成纤维细胞较少×200
图1C PP6圆形或短梭形细胞的数量明显增加，超过80% ×200
图1D 细胞增殖、迁移逐渐形成规律性的平行排列。极易融合，生长呈方向性，细胞增殖速度减慢，×200
图1E、F 细胞特异性desmin染色呈阳性，荧光显微镜可见细胞发出绿色荧光×400
2.2 生长曲线 第2日开始进入对数生长期，第5日后由于接触抑制，增殖速度减慢(图2)。图2 传代MDSCs的生长曲线
2.3 对PP6的细胞表型鉴定 肌源性干细胞本身具有特征性的外形， 其胞浆中含有结蛋白(desmin) 可通过细胞免疫荧光方法鉴定。本实验采用小鼠抗大鼠desmin一抗对肌源性干细胞进行鉴定，细胞质desmin染色阳性（图1E，1F），细胞胞质呈现绿色荧光。观察500个细胞，90%为desmin阳性。
3 讨 论
近年在骨骼肌中发现了一群被称为MDSCs的细胞群体。预期它们在组织工程应用领域特别是细胞移植和基因治疗方面前景广阔。国外已在进行大量MDSCs介导的相关的基因治疗和组织工程的动物实验［6-8］，并取得了较明显的效果。因此建立和完善MDSCs培养方法，获取高纯度的细胞具有重要实用价值。
骨骼肌细胞是由胚胎的生肌节和各处的间充质细胞分化而成，在肌膜和基膜之间有一种体积较小的扁平成立方形细胞，称为卫星细胞［9］，是保留在成年骨骼肌内具有增殖分化能力的单潜能成肌干细胞，这种组织特异性的干细胞在出生后骨骼肌的损伤、修复和维持中起重要作用。有证据表明新近发现的肌源性干细胞(MDSCs)是一群与卫星细胞完全不同的细胞群。可能是一群未向任何方向定型的原始干细胞。
lee等［7］31-37从骨骼肌细胞中发现了MDSCs，与卫星细胞相比，其具有更多的分化潜能，不仅能分化成骨骼肌纤维，促进肌组织再生，还能分化成成骨细胞，促进骨骼愈合［5］，被认为是卫星细胞的前体。贴壁前的MDSCs呈小而圆的球形，折光性强，刚贴壁仍为圆形，贴壁后的MDSCs呈纺锤形，延迟分瓶时会融合成成熟的多核肌管，这与成纤维细胞不同。preplate技术利用差速贴壁获取MDSCs，其原理是成纤维细胞、内皮细胞的贴壁能力强于卫星细胞，卫星细胞的贴附能力又强于MDSCs，4 d内即可完全贴壁而此时MDSCs仍处于悬浮状态［6］1085-1100，实验中发现，组织块中加入胶原酶后很快就变成了乳糜状，胰酶对组织具有很好的离散作用，再通过反复吹打可将细胞从基膜中分离出来，得到的细胞为成纤维细胞、白细胞、内皮细胞、卫星细胞及MDSCs的混合物，利用差速贴壁法4 d后处于悬浮状态的细胞移出培养即为纯化的MDSCs。MDSCs本身具有特征性外形，我们通过结蛋白desmin染色鉴定其肌源性，通过其多向分化的能力来鉴定其干细胞特性。实验中我们还发现，随着乳鼠出生天数的延长，所取得的MDSCs的数量和活力逐渐下降，但出生时间太短，活力太差，又不利于取材。新出生3～5 d的大鼠最适宜进行原代取材。
结蛋白（desmin）是中间丝蛋白的一种，是成肌分化的早期的标志，常作为肌源性的标志，虽然成纤维细胞与骨骼肌内血管平滑肌细胞也产生结蛋白，但此细胞中结蛋白含量低，与抗体产生弱阳性反应，且仅有15％的desmin阳性率［10］，而通过本方法获取的MDSCs中desmin阳性率高达90%，由此可进行初步鉴别。
MDSCs属于成体干细胞，具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长等优点，在组织工程和基因治疗中具有广泛的应用前景。通过对常规技术的改良，本研究建立了一种稳定高效的新生大鼠MDSCs分离纯化技术，并成功对MDSCs进行了鉴定，为MDSCs在基因治疗和组织工程的临床应用打下了基础。
参考文献
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