【摘要】 目的 观察全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid，ATRA)对甲状腺鳞癌细胞株SW579诱导分化作用中细胞增殖的影响。方法 以终浓度为10-7、5×10-7、10-6、5×10-6、10-5 mol/L的全反式维甲酸作用SW579细胞株，在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态变化；采用MTT比色法测定细胞存活率；流式细胞仪检测细胞周期。结果 全反式维甲酸能使细胞趋向良性分化，抑制了肿瘤细胞增殖，使细胞滞留在S期。结论 全反式维甲酸对甲状腺鳞癌细胞株SW579有剂量依赖性的增殖抑制作用，并且在低浓度时（10-7、5×10-7、10-6 mol/L）可能对细胞具有诱导分化作用。
【关键词】 全反式维甲酸 甲状腺鳞癌 细胞增殖 细胞分化
Abstract：Objective To observe the influences of all-trans-retinoic acid (ATRA) on proliferation of of thyroid squamous cell carcinoma cell line (SW579) in inducing differentiation in vitro.Methods Treated with different doses of ATRA (final concentration of 10-7，5×10-7，10-6，5×10-6，10-5mol/L)， the cells were observed with an inverted microscopea convert microscope in shape；The the proliferation of the cells was observed with MTT and the cell cycle was measured by flow cytometry . Results After cells were treated with ATRA， the malignant phenotypes of cells gradually changed to the mature cells. The proliferation index decreased markedly. The cell cycle was arrested at S stage.Conclusions ATRA can inhibit the proliferation of the cell line SW579 with a dose-dependent manner，and maybe the thyroid cancer cells were induced differentiation in low concentration（10-7mol/L，5×10-7mol/L，10-6mol/L）.
Key words：ATRA; thyroid squamous cell carcinoma; proliferation; differentiation
诱导肿瘤细胞分化成为正常或接近正常的细胞是治疗肿瘤的一种新途径。ATRA是维生素A的衍生物，是一种公认的肿瘤细胞分化诱导剂，能明显抑制某些肿瘤细胞的恶性增殖，对肿瘤细胞具有诱导分化作用，临床上已用于治疗早幼粒细胞白血病，并取得较好疗效。近几年发现［1，2］，全反式维甲酸能够诱导高分化型甲状腺癌细胞分化，其作用机制可能是通过RARβ受体来调节的，但对甲状腺鳞癌的研究还未见报道。本研究初步探讨全反式维甲酸对体外培养的甲状腺鳞癌细胞株SW579的增殖抑制及诱导分化的作用，为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
ATRA (SIGMA公司)；L15培养液（SIGMA公司）；四甲基氮唑兰（SIGMA公司）；倒置显微镜（JAPANOLYMPUS TOKYO）；流式细胞仪（美国贝克曼库尔特有限公司）；Multiskan Ascent自动酶标检测仪。
1.2 细胞培养及实验分组
甲状腺鳞癌细胞株SW579购自上海生命科学院细胞和生物化学研究所。培养基为L15，含10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL的链霉素，在饱和湿度、37 ℃、不加入CO2孵箱中培养。对冻存细胞进行复苏，当细胞汇合至培养瓶底面积80%左右时进行传代培养。当细胞处于对数生长期时，以105/mL浓度接种于25 cm2的培养瓶中，24 h后待细胞贴壁后给药，使ATRA终浓度分别为10-7、5×10-7、10-6、5×10-6、10-5mol/L，对照组加入5 μＬ无水乙醇［乙醇浓度小于0.1%(V/V)，此浓度对细胞生长无影响］。
1.3 倒置显微镜下观察细胞形态
ATRA作用48 h后取出培养瓶，于倒置显微镜下观察细胞形态特征。
1.4 MTT法检测细胞存活率
李男，等：维甲酸对甲状腺鳞癌细胞株SW579细胞增殖的影响辽宁医学院学报 2008年2月，29(1)取对数生长期细胞，以1×105/mL接种于96孔板上，培养24 h后，加入不同浓度的全反式维甲酸，各浓度组8复孔，并设8复孔对照。培养48 h后，加入20 μＬ MTT (5 mg/mL)孵育4 h。弃去培养液，加入150 μＬ二甲基亚砜，室温30 min后用酶标仪570 nm测吸光度值(A值)，测定细胞存活率。细胞存活率=(实验组A值/对照组A值)×100％。
1.5 流式细胞仪检测细胞周期
ATRA作用48 h后，以胰酶-EDTA消化，用4 ℃预冷的PBS吹打成单细胞悬液，离心弃上清。用PBS再洗1次，调细胞密度为106 /mL以上，调整至终体积为100 μL，加入DNAStain染色液(RNase 终浓度 50 mg/L，碘化丙啶终浓度100 mg/L，Triton-X100终浓度1 mg/L)1 000 μL，室温避光15 min，上机测试。
1.6 统计学处理
实验所得数据以x±s表示，应用SPSS统计软件13.0进行单因素方差分析及q检验。
2 结 果
2.1 ATRA对细胞形态特征的影响
与对照组相比，ATRA低浓度组（10-7、5×10-7、10-6 mol/L）细胞胞体变小且较规则，核浓缩，胞质增多，肿瘤细胞有向正常形态转化的趋势，见图1（B、C）；ATRA高浓度组（5×10-6、10-5 mol/L）细胞生长速度变慢，大部分细胞由多角形及长梭形回缩成球形，没有向成熟分化的趋势，见图1（D）。A 对照组细胞B ATRA浓度为10-7 mol/LC ATRA浓度为10-6 mol/LD ATRA浓度为10-5 mol/L图1 ATRA处理前后的SW579细胞形态（×200）
2.2 细胞存活率检测结果
ATRA各浓度组细胞的存活率见表1，SW579细胞株经不同浓度ATRA作用后，各组细胞存活率随着药物浓度的升高而降低（P＜0.05），说明ATRA可抑制细胞生长，且呈剂量依赖性。 表1 ATRA对SW579细胞存活率的影响
2.3 细胞周期检测结果
细胞周期检测显示，SW579细胞株经不同浓度ATRA作用后，随着药物浓度的升高G1和G2/M期细胞在细胞周期中所占比例减少，S期则有所增加（P＜0.01），见表2。表2 ATRA对SW579细胞周期的影响Δ表示与对照组相比，P＜0.01；#表示与前一组相比，P＜0.05；##表示与前一组相比，P＜0.01
3 讨 论
目前研究表明，诱导肿瘤细胞分化已经成为一种治疗肿瘤的有效方法。在分化诱导剂作用下，诱导肿瘤细胞向正常细胞或接近正常细胞的表型和功能分化。维甲酸是体内一种重要的生物活性物质，不但对某些组织细胞生长发育及功能维持起重要作用，还能抑制肿瘤细胞生长及诱导某些肿瘤的分化、细胞周期的阻滞和凋亡。全反式维甲酸（ATRA）是一种公认的分化诱导剂，对多种肿瘤细胞有诱导分化作用，如胃癌、表皮内原位癌、乳癌、神经母细胞瘤、肝癌、甲状腺癌等等。Schmutzler C［3］等用全反式维甲酸作用于分化较好FTC133细胞株，肿瘤细胞生长受到明显抑制，包建东等［4］报道ATRA在低浓度组（10-7～10-6 mol/L）对甲状腺癌细胞株FTC 133和KI有诱导分化作用。
细胞形态学改变是细胞分化的基本特征，是推断细胞分化诱导成功的重要标志之一。本实验中，在ATRA的作用下，甲状腺鳞癌SW579细胞有向正常形态转化的趋势。对照组细胞形态多变，体积偏大。与对照组相比，低浓度ATRA组细胞体积变小，细胞形状较规则，核变小且较规则，分裂相少见；高浓度组细胞生长缓慢，密度低，大多数细胞回缩成球形。通过倒置显微镜证实，ATRA在低浓度（10-7、5×10-7、10-6 mol/L）时有可能促进SW579细胞向正常细胞分化，在高浓度（5×10-6、10-5 mol/L）时未见促分化作用。
在本研究中，我们发现不同浓度的ATRA（10-7～10-5 mol/L）对SW579细胞株的增殖均有抑制作用，且呈剂量依赖性。流式细胞术检测细胞周期结果显示，经不同浓度ATRA作用后，随着药物浓度的升高G1和G2/M期细胞在细胞周期中所占比例减少，S期细胞数目增加，ATRA使细胞阻滞于S期，诱导细胞分化的发生。上述实验结果表明ATRA对SW579细胞株有增殖抑制作用，并且在低浓度（10-7、5×10-7、10-6 mol/L）对细胞可能具有诱导分化作用。关于ATRA可能诱导该细胞株分化的作用还需利用其他检测方法进行深入研究。
参考文献
［1］ Elisei R， Vivaldi A， Agate L， et al. All-trans-retinoic acid treatment inhibits the growth of retinoic acid receptor beta messenger ribonucleic acid expressing thyroid cancer cell lines but does not reinduce the expression of thyroid-specific genes［J］.Clin Endocrinol Metab，2005，90(4)：2403-2411.
［2］ Junichi Kurebayashi，Katsuhiro ，et al.All-Trans-Retinoic Acid Modulates Expression Levels of Thyroglobulin and Cytokines in a New Human Poorly Differentiated Papillary Thyroid Carcinoma Cell Line，KTC-11［J］. Clin Endocrinol Metab，2000，85(8):2889-2896.
［3］ Schmutzler C， Hoang-Vu C， Ruger B， et al.Human thyroid carcinoma cell lines show different retinoic acid receptor repertoires and retinoid responses［J］. Eur Endocrinol，2004 ，150(4):547-556.
［4］ Fumihiko Furuya，Hiroki Shimura.Histone Deacetylase Inhibitors Restore Radioiodide Uptake and Retention in Poorly Differentiated and Anaplastic Thyroid Cancer Cells by Expression of the Sodium/Iodide Symporter Thyroperoxidase and Thyroglobulin ［J］.Endocrinology，2004，145(6):2865-2875.