作者：陈禄彪， 揭育胜， 许 镇， 徐启桓， 彭晓谋， 高志良
【摘要】 【目的】 探讨寡聚腺苷酸合成酶基因-1(OAS-1)位点 rs2660的单核苷酸多态性(SNP)与慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者自发性HBeAg血清转换的关系。【方法】 收集126例慢性HBV感染者(HBeAg阳性组58例，HBeAb阳性组68例)和无HBV感染者(对照组72例)的外周血，进行DNA提取和扩增，再利用竞争分化聚合酶链反应(CD-PCR)进行扩增，并结合酶免疫法显色以检测该SNP的基因型，两组间基因型比例或等位基因频率采用?字2检验和优势比(OR)计算。【结果】 在HBeAg阳性组SNP rs2660基因型GG + GA比例为29.3%(17/58)、等位基因G频率为16.4%(19/116)，而在HBeAb阳性组分别为47.1%(32/68)和28.7%(39/136)，对照组分别为52.7%(38/72)和30.6%(44/144);HBeAg阳性组与HBeAb阳性组或对照组之间的差异均存在统计学意义(基因型：P = 0.042和0.007;等位基因：P = 0.021和0.008)，而HBeAb阳性组与对照组之间的差异无统计学意义(基因型：P = 0.499;等位基因：P = 0.731)。【结论】 SNP rs2660等位基因G可能有助于慢性HBV感染者发生自发性HBeAg血清转换，其基因型检测对于干扰素治疗慢性HBV感染者可能有一定的疗效预测价值。
【关键词】 寡聚腺苷酸合成酶; 单核苷酸多态性; 乙型肝炎病毒; 等位基因; 基因型
Abstract： 【Objective】 The aim of this study was to investigate the relationship between the single nucleotide polymorphism (SNP) rs2660 of oligoadenylate synthetase gene-1 (OAS-1) and spontaneous HBeAg seroconversion on patients with chronic hepatitis B virus (HBV) infection. 【Methods】 Blood samples were collected from 128 patients with chronic HBV infection (58 HBeAg positive， 68 HBeAb positive)， and 72 normal control cases without HBV infection. Chromosomal DNA was extracted and OAS-1 gene was amplified. SNP genotyping was performed with the enzyme immunoassay (EIA) after the competitively differentiated polymerase chain reaction (CD-PCR). Odds ratio and chi-square test were applied in statistical analysis. 【Results】 In HBeAg positive group， frequencies of genotype GG plus GA and allele G were 29.3% (17/58) and 16.4% (19/116) on SNP rs2660， respectively. They were 47.1% (32/68) and 28.7% (39/136) in HBeAb positive group， 52.7% (38/72) and 30.6% (44/144) in normal control group， respectively. Differences between HBeAg positive group and HBeAb positive group or normal control group were statistically significant (genotype： P = 0.042 and 0.007; allele： P = 0.021 and 0.008). But they weren?蒺t between HBeAb positive group and normal control group (genotype： P = 0.499; allele： P = 0.731). 【Conclusion】 Allele G on SNP rs2660 of OAS-1 gene maybe benefit patients with chronic HBV infection to achieve spontaneous HBeAg seroconversion. Genotyping on this SNP may be predicting valuable for interferon therapy for chronic HBV infection.
人寡聚腺苷酸合成酶(oligoadenylate synthetase， OAS)是一类由干扰素(interferon， IFN)诱导产生的酶蛋白，由OAS-1、OAS-2和OAS-3基因编码，具有激活潜在性RNA酶(latent Rnase， RNase L)降解病毒mRNA、抑制病毒蛋白合成和促进病毒感染细胞发生凋亡的作用，在先天性抗病毒免疫中发挥重要的作用[1-2]。已有研究发现OAS-1基因上存在的多个SNP可能对丙型肝炎、SARS等病毒感染性疾病的转归产生影响[3-4]，目前国内外关于OAS-1基因SNP对慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)感染影响的研究甚少，孔晓飞等[5]发现SNP rs2660与HBV自限性感染呈弱相关，具体可能机制未能阐述。为此，本研究利用先前建立的相对经济和简便的竞争分化聚合酶链反应[6](competitively differentiated polymerase chain reaction， CD-PCR)技术，对OAS-1基因上SNP rs2660进行基因型检测，探讨它与慢性HBV感染者自发性HBeAg血清转换的关系，了解检测该SNP基因型作为HBeAg血清转换预测指标的可能性。
1 材料与方法
1.1 研究对象
收集2006年5月至2007年5月在我院感染科就诊的慢性HBV感染病例，根据入选前1个月内在本院的乙肝两对半检查结果(AXSYM)分成HBeAg阳性组和HBeAb阳性组，两组间的年龄、性别比例、谷丙转氨酶水平均具有可比性。入选标准：年龄8 ～ 30周岁，无接受IFN、核苷(酸)类似物等抗HBV药物治疗历史，无明确合并HCV、HDV、HIV感染，HBeAb阳性组者 HBV DNA &< 1 × 105 拷贝/mL(PE5700荧光定量PCR)和血清HBV前C区G1896A变异株阴性(方法参见文献[7])。另外收集72名无HBV感染者作为正常对照。采静脉血5 mL肝素抗凝保存于-20 ℃冰箱待检。
1.2 引物探针
OAS-1基因cDNA的参考序列(GenBank， Acce. No. NC_000012)，引物和探针用Primer Premier软件自行设计并由Invitrogen公司合成(表1)，用Milli-Q级ddh3O稀释成10 nmol/mL。
1.3 试剂和设备
DNA提取试剂盒购自美国Omega公司，PCR试剂、T4 DNA连接酶、E.Coli JM109感受态细胞和内切酶NotⅠ、 MluⅠ均购自Takara大连公司，质粒载体pCI-neo购自美国Promega公司，DNA凝胶纯化试剂盒购自德国QiaGen公司，辣根过氧化物酶标记的地高辛抗体(anti-DIC)和异硫氰酸荧光素抗体(anti-FIFC)购自瑞士Roche公司。PCR扩增采用PTC-200热循环仪、DNA测序采用ABI 3730XL测序仪，光密度测定采用Labsystem MK3酶标仪。
1.4 DNA提取和基础PCR扩增
取抗凝血细胞100 μL用ddh3O 200 μL稀释，用Omega试剂盒进行DNA提取，DNA提取终液为50 μL，保存于-20 ℃备用。对SNP所在DNA片断进行基础PCR扩增，50 μL反应体系组成：10 × PCR缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2) 5 μL、2.5 mmol/L dNTP液4 μL、DNA提取液5 μL、ddh3O 34 μL、引物OAS1-S和OAS1-A各1 μL、TaqDNA聚合酶1.5 U;反应步骤：94 ℃预热5 min、94 ℃变性40 s、52 ℃退火40 s、72 ℃延伸60 s、循环数35个、最后延伸5 min。
1.5 制备CD-PCR阳性对照质粒DNA
随机取一例基因组DNA为模板，上游引物分别为OAS1-GC或OAS1-AC和下游引物OAS1-CLA进行扩增，除引物外50 μL PCR反应体系组成和反应条件同基础PCR扩增，扩增产物经NotⅠ、 MluⅠ双酶切后进行2%琼脂糖凝胶电泳，用QiaGen DNA纯化试剂盒提取DNA并与质粒载体pCI-neo连接，再用E.Coli JM109感受态细胞进行转化，挑取克隆菌落在LB培养基增菌，随后提取质粒DNA作为CD-PCR检测两个SNP不同等位基因的阳性对照。
1.6 CD-PCR扩增
经优化得到25 μL反应体系：10 × PCR缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2) 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP溶液0.125 μL、Taq DNA聚合酶2.0 U、基础PCR产物1.0 μL、下游公共引物OAS1-1 0.10 μL、上游混合引物OAS1-G 0.38 μL和OAS1-A 0.30 μL，最后加ddh3O至总反应体积25 μL;PCR反应条件：94 ℃变性1 min、56 ℃复性2 min、72 ℃延伸2 min、共2个循环，然后94 ℃变性30 s、68 ℃复性30 s、72 ℃延伸40 s、最后72 ℃延伸5 min，共20个循环。1.7 酶免疫显色
用1 × 缓冲液(0.1 mol/L Na2CO3和0.1 mol/L NaHCO3，体积比为35：65，5 mmol/L EDTA，pH 9.6)配制探针液OAS1-P(0.04 OD/mL)，然后进行包板。取每个CD-PCR产物各10 μL加上下对应两孔，每孔加入50 μL变性液室温下变性10 min，随后各孔加入50 μL中和杂交液，60 ℃水浴30 min 后洗涤拍干。上孔加入辣根过氧化物酶标记的anti-DIC酶标液(1：1 500) 50 μL以检测等位基因G，下孔加入辣根过氧化物酶标记anti-FITC酶标液(1：2 000) 50 μL以检测等位基因A，37 ℃水浴30 min后洗涤拍干。加入含有四甲基联苯胺的底物缓冲液，10 min后显色并加入反应终止液，酶标仪进行A值测定(波长450 nm)，上下两孔A值比(R)≥2.0判为基因型GG，R≤0.5判为基因型AA，0.5 &< R &< 2.0判为基因型GA。
1.8 数据统计
结果采用SPSS 13.0软件进行分析，两组间率的比较采用?字2检验，并计算相应的优势比(odds ratio， OR)和95%置信区间(confidence interval， CI); P &< 0.05认为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 基础PCR扩增和酶反应显色结果
取基础PCR扩增的DNA液5 μL在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，结果显示符合目的片段468 bp大小(图1A);取各样本CD-PCR产物各10 μL加入上下对应两孔，经酶免疫反应酶标仪判读SNP基因型，显色效果如图1B。
2.2 CD-PCR产物测序结果
各取2例基因型分别为GG、GA和AA的CD-PCR扩增产物进行测序，测序结果验证了CD-PCR结合酶显色方法对SNP基因型检测的准确性。
2.3 CD-PCR基因型检测结果
所用标本的基因型均成功检测(表2)，基因型GG和GA比例或等位基因G频率在HBeAg阳性组明显低于HBeAb阳性组或正常对照组，而HBeAb阳性组和正常对照组之间差异无统计学意义，提示等位基因G可能有利于宿主发生自发性HBeAg血清学转换(OR = 2.053， P = 0.021);同样地，基因型GG和GA可能有利于宿主发生自发性HBeAg血清学转换(OR = 2.114， P = 0.042)。
3 讨 论
IFN是机体抵抗病毒感染的先天性免疫中重要的细胞因子，OAS-RNase L是IFN抗病毒感染的重要途径之一。SNP rs2660 位于OAS-1基因的3′-UTR区，对OAS-1基因转录活性的影响及其机制尚不十分清楚。He等[4]的研究认为SNP rs2660等位基因G对SARS有保护作用，机制并未阐明;孔晓飞等[5]发现SNP rs2660与HBV自限性感染呈弱相关。以上资料提示OAS-1基因的SNP对HBV感染的转归可能产生影响，其与HBeAg血清转换的关系也值得深入探讨。事实上，本研究发现，在年龄小于30岁的HBV感染患者中，SNP rs2660等位基因G以及基因型GG和GA均有利于慢性HBV感染者发生自发性HBeAg血清转换。本研究的观察对象为小于30岁的HBV感染患者，主要考虑到年龄小的患者在肝炎充分活动前就出现自发性HBeAg血清转换可能更能体现个体遗传素质的优越性，这也可能是本研究观察到OAS-1基因SNP rs2660与自发性HBeAg血清转换较强相关性的原因。
我们先前在OAS-1基因SNP rs10774671上有与此相似的发现[8]，该SNP位于OAS-1外显子E下游，其等位基因决定了mRNA的剪接，当等位基因为G时表达相应产物为p46，而为A时表达产物为p48和/或p52[9-10]。产物p46具有更高的酶催化活性，从而导致2′-5′OA合成增多[8，10]，可能更有效地抑制病毒复制和病毒蛋白的合成。而SNP rs2660位于rs10774671的下游，虽然本实验并没有对所有样本进行DNA测序验证，但已有一些研究发现这两个SNP存在不平衡连锁关系[9]，这可能是SNP rs2660对HBeAg血清转换产生影响的真正原因。
目前，IFN仍然是抗HBV治疗的重要药物之一，在抗HBV治疗过程中出现HBV DNA载量下降伴随HBeAg血清转换往往是取得良好应答的重要评价指标。而在本研究的结果提示，不同个体的OAS-1基因SNP rs2660等位基因可能与自发性HBeAg血清转换存在关系，因此该SNP基因型检测可作为自发性HBeAg血清转换或IFN抗HBV治疗疗效的预测指标。
参考文献
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