【摘要】 【目的】 探讨四氯二苯并二 ■英(TCDD)对子宫内膜异位症小鼠模型的影响及其分子学机制。 【方法】 采用小鼠自体子宫内膜移植法建立小鼠子宫内膜异位症模型，分别给予TCDD 0、l、3、10 μg/kg剂量灌胃，每21 d 1次，于建模术后3、6、9周处死，鉴定异位病灶的形成，测量异位病灶体积。采用免疫组化法和RT-PCR法检测各组小鼠异位子宫内膜组织中芳香烃受体(AhR)和细胞色素P450 1A1(CYP1A1)表达水平。【结果】 ①染毒组小鼠异位病灶体积的增加与染毒剂量和时间具有明显的正相关性(r = 为0.727、0.553，均P &< 0.05);②染毒组小鼠异位子宫内膜AhR蛋白较对照组增强(P &< 0.05);且随染毒剂量增加和染毒时间延长，AhR蛋白表达相应增加(r分别为0.687、0.442，均P &< 0.01);③随染毒剂量增加，CYP1A1蛋白表达相应增加(r = 0.640，P &< 0.01)，对照组未检测到CYP1A1蛋白表达;④染毒组小鼠异位子宫内膜AhR mRNA较对照组增强(P &< 0.05)。随染毒剂量增加和暴露时间延长，AhR mRNA表达相应增加(r分别为0.565、0.635，P &< 0.01);⑤随染毒剂量的增加，CYP1A1 mRNA表达明显增加(r = 0.659，P &< 0.01)，对照组小鼠异位子宫内膜病灶中未检测到CYP1A1mRNA。【结论】 TCDD可促进小鼠模型异位子宫内膜病灶的发展，其机制可能与AhR及其下游基因CYP1A1激活有关。AhR及CYP1A1的表达增强是二 ■英暴露的生化指标。
【关键词】 四氯二苯并二 ■英; 子宫内膜异位症; 小鼠; AhR; CYP1A1
Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) on development of endometriosis in a mouse model from perspective of molecular mechanism. 【Methods】 The endometriosis mouse model was established with autotransplantation of endometrium. Twenty-one days prior to induction surgery which produces endometriosis， female mice were pretreated with 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) at 0， 3， or 10 mg TCDD/kg. Animals were treated again at the time of surgery and at 3， 6， and 9 weeks following surgery. Evaluation of ectopic focuses diameter were made at 3， 6， 9 weeks post surgery. The AhR and CYP1A1 expression on ectopic endometrium were identified by immunohistochemistry and RT-PCR assays. 【Results】 ①With increased time and dose of TCDD exposure， it produced a dose-dependent increase in endometriotic site diameter when all time points were pooled within each dose in mice (r = 0.727 and 0.553 respectively， both P &< 0.05). ②The expression of AhR protein on ectopic focuses in mice were higher in the TCDD exposure group than those in control group， and presented time-dose dependent increase (r = 0.687 and 0.442， both P &< 0.01). ③The higher dose of exposure increased， the higher CYP1A1 protein expressions enhanced (r = 0.640， P &< 0.01). ④As compared with the control group， the expression of AhR mRNA in ectopic focuses of mice were higher in the TCDD exposure group， and show time-dose dependent increase (r = 0.565 and 0.635， both P &< 0.01). ⑤The higher dose of exposure increased， the higher CYP1A1 mRNA expression enhanced (r = 0.659， P &< 0.01). 【Conclusion】 TCDD can promote progression of ectopic focus of endometriosis in the mouse 子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)是育龄妇女的常见病，但其发病机制尚不清楚。近年来流行病学调查发现二■英(dioxin)污染越严重的国家或地区，其EMS的发病率越高[1]。所以，推测涉及外来物解毒的酶活性的改变可能是EMS的危险因素[2]。毒理研究发现二■英通过与芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)结合并激活AhR介导的信号途径，发挥不同毒性效应[3]。细胞色素P450 1A1(Cytochrome P450 1A1，CYP1A1)属重要的I相解毒酶，是目前研究最多的AhR反应基因，报道称其基因多态性可能与子宫内膜异位症的形成密切相关[2]。本文选择二■英中最具代表性的2，3，7，8-四氯二苯并-对-二■英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)为研究对象，探讨在EMS模型中不同剂量及时间TCDD作用模式下TCDD样配体AhR及其下游活性物质CYP1A1的基因表达状态，探寻TCDD在EMS中可能涉及的分子水平作用机制。
1 材料和方法
1.1 动物建模
参考1996年Cummings的啮齿类动物TCDD实验模式建模[4-5]，60只成熟未孕SPF级ICR雌性小鼠(体质量为28 ～ 32 g，购自南通大学实验动物中心)随机分为3个时间组(3周组、6周组、9周组)，每组20只，每组再随机分成4个TCDD(标准品纯度 &> 99%，购自Cerilliant公司)剂量组(每组5只)，其分别为对照组(0 μg/kg)、低剂量组(1 μg/kg)，中剂量组(3 μg/kg)和高剂量组(10 μg/kg)。通过灌胃法染毒，每21 d给药1次，首次给药时间记为0 d，在给药的第21天，再次给药同时行小鼠自体子宫内膜移植术[6]，自一侧子宫角取约2 mm × 1 mm组织2块，分别缝合在小鼠腹膜、卵巢。分别在术后3、6、9周采用脱臼法依次处死各组小鼠，3周组小鼠共暴露TCDD 2次;6周组小鼠共暴露TCDD 3次;9周组小鼠共暴露TCDD 4次。
1.2 免疫组织化学检测
AhR(PRT 9)单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)和CYP1A1(B-4)单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)分别作为一抗。石蜡切片，采用SP法，染色步骤按试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)内说明进行，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)显色。用已知阳性的小鼠胎盘组织作阳性对照，以磷酸盐缓冲液替代一抗作阴性对照。显微镜下，细胞胞浆中具有棕褐黄色颗粒者为阳性细胞。结果采用计算机图像分析软件Image-Pro plus 4.5 对AhR及CYP1A1阳性部位进行原位半定量检测，每张切片随机选用5个视野，选取阳性部位，测定累积光密度(integral optical density，IOD)、面积(area)、计算相对光密度(相对IOD = IOD/area)值，而5个视野的相对IOD平均值作为该切片的代表值。
1.3 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测
AhR、CYP1A1和内参照物β-actin引物应用软件Primer5.0设计，由南京金思特科技有限公司合成，与从Gene Bank下载的mRNA序列核对无误。AhR上游引物：5′-TACTCCACTTCAGCCACC-3′，下游引物：5′-TGTCATGCCACTTTCTCC-3′，241 bp;CYP1A1上游引物：5′-AGTATTTGGTCGTGTCA GTAG-3′，下游引物：5′-TCCAGGGAAGAGTTAGGC -3′，494 bp;β-actin上游引物：5′-ATGGATGACGAT ATCGCT-3′，下游引物：5′-ATGAGGTAGTCTGTCA GGT-3′，184 bp。参照Trizol Reagent(美国Invitrogen公司)说明书，采用一步法提取子宫内膜异位灶组织的总RNA。RT-PCR参照逆转录试剂盒TaKaRa RNA PCR kit (AMV) ver3.0 (大连宝生物工程有限公司)说明书进行。扩增条件：94 ℃预变性2 min;94 ℃变性30 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，扩增30个循环。2%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像分析系统摄影，扫描PCR产物溴乙锭染色后强度，分别行定性及半定量检测。
1.4 统计学分析
采用SPSS 15.0统计软件进行分析处理，数据以x ± s表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD(Least-significant difference)法进行组间比较，多个变量之间相关性用皮尔逊相关分析(Pearson correlation test)，P &< 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 TCDD对EMS小鼠的影响
建模术后3周开腹鉴定异位病灶的形成，对照组(n = 5)和染毒组(n = 15)小鼠的卵巢和腹壁种植处均建模成功，形成典型的异位病灶。Pearson相关分析显示，染毒时间和剂量与异位病灶面积的增长呈明显的正相关(r分别为0.727、0.553，均P &< 0.01)。对照组成模小鼠的异位种植灶在不同时间点(术后3、6、9周)，其外观大体一致。
2.2 AhR在小鼠异位子宫内膜病灶中的表达
免疫组化显示对照组和染毒组小鼠子宫内膜异位病灶中均有AhR阳性反应表达。AhR蛋白于对照组小鼠子宫内膜腺上皮细胞的胞浆上，AhR蛋白在染毒组小鼠子宫内膜腺上皮和基质细胞的胞浆均有表达，主要位于基质细胞胞浆(图1)。AhR蛋白在染毒组小鼠子宫内膜异位病灶中表达增强，和对照组相比，差异有统计学意义(P &< 0.05)。6周和9周时，不同染毒剂量组AhR蛋白表达差异明显(P &< 0.05);随着染毒剂量的增加和染毒时间延长，AhR蛋白表达也相应增加(r分别为0.687、0.442，均P &< 0.01;表1)。
2.3 CYP1A1在小鼠异位子宫内膜病灶中的表达
CYP1A1蛋白位于染毒组小鼠子宫内膜腺上皮细胞的胞浆，高剂量染毒组CYP1A1蛋白表达明显增加，和低剂量染毒组相比，差异有统计学意义(P &< 0.05)。随染毒剂量增加，CYP1A1蛋白表达相应增加(r = 0.640，P &< 0.01)，染毒时间延长和CYP1A1蛋白表达无明显相关性(r = 0.038，P &> 0.01)，对照组小鼠子宫内膜异位病灶上未检测到CYP1A1蛋白表达(图2，表2)。
2.4 AhR mRNA在小鼠异位子宫内膜病灶中表达
染毒组小鼠异位子宫内膜病灶中AhR mRNA表达明显增加，和对照组比较，差异有统计学意义(P &< 0.05)，6周和9周时，各染毒剂量之间比较，AhR mRNA表达水平差异明显，有统计学意义(P &< 0.05)。随染毒剂量增加和暴露时间延长，AhR mRNA表达相应增加(r分别为0.565、0.635，P &< 0.01;表3，图3)。
2.5 CYP1A1 mRNA在小鼠异位子宫内膜病灶中的表达
染毒组小鼠异位子宫内膜病灶中检测到CYP1A1 mRNA表达，同一时间组内(3，6，9周)不同染毒剂量比较其表达差异明显，有统计学意义(P &< 0.05)。随染毒剂量的增加，CYP1A1 mRNA表达明显增加(r = 0.659， P &< 0.01)，暴露时间的延长并没有增加其mRNA表达(r = 0.068， P &> 0.05)，对照组小鼠异位子宫内膜病灶中未检测到CYP1A1 mRNA。见表4，图4。
3 讨 论
3.1 TCDD在EMS发生中的作用
近年来，越来越多的学者发现EMS发病率的增高可能与现代环境污染释放的环境毒素有关，其中毒性最强的环境毒素二■英与EMS之间关系引起世界广泛关注[1]。比利时也是世界二■英污染较严重的国家之一，研究发现比利时女性血液中二■英的毒性当量(toxic equivalents，TEQ)明显高于意大利女性[7]，就比利时国家EMS和二■英相关性的调查中发现，随着血液中二■英TEQ的升高，腹腔EMS和子宫腺肌症的发病危险性也会相应增加[8]，进一步证实了二■英可能是EMS发病的致病因素之一。本实验EMS小鼠模型研究也证实了TCDD可促进小鼠EMS异位病灶的生长，且有时间和剂量的依赖性[5]。尽管如此，两者的关联性从动物模型至人群流行病学调查仍存在争议[9-10]。研究结果的不一致性考虑可能是因为病例组和对照组的筛选标准、研究设计及分析方法等不同所导致。因此，二■英和EMS的相关性有待更多的研究来证实。
3.2 AhR在EMS发展中的作用
所有TCDD样配体均通过表达于子宫内膜细胞表面的孤核受体AhR激活[11]。AhR基因敲除(AhR-/-)小鼠实验发现二■英免疫毒性发挥是AhR依赖性的，AhR-/-小鼠暴露TCDD后，可抵抗TCDD的免疫抑制毒性，而AhR+/+的小鼠暴露TCDD后，出现免疫抑制，抵抗力下降，肿瘤易感性增加[12]。提示AhR是TCDD发挥效应的重要前提。
本研究结果显示对照组和染毒组小鼠的子宫内膜异位病灶中均有AhR蛋白表达。对照组AhR蛋白仅表达在子宫内膜腺上皮细胞的胞浆;而TCDD暴露组小鼠子宫内膜异位病灶中，AhR不仅位于腺上皮细胞胞浆，还广泛表达于基质细胞的胞浆，提示TCDD可诱导AhR在子宫内膜中广泛表达。正常情况下，激素、细胞因子、生长调节因子等通过子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞相互作用调控子宫内环境的稳态，如孕激素通过子宫内膜基质细胞抑制雌激素促腺上皮细胞的增殖[13]。故推测TCDD诱导子宫内膜基质细胞上的AhR大量表达并与之结合，干扰子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的相互作用，影响子宫内膜的功能。同时本实验发现TCDD可促进小鼠子宫内膜异位病灶AhR蛋白和mRNA表达，具有时间和剂量依赖性，提示TCDD促小鼠子宫内膜异位病灶发展的作用是通过AhR信号介导的。根据受体机制，受体水平上调会增加对配体的敏感性，从而产生最大效应。推测AhR表达上调会增加对TCDD敏感性，诱导AhR反应基因转录表达增加，产生最大效应。
3.3 CYP1A1在EMS发展中的作用
CYP1A1是目前研究最多的AhR反应基因，属于CYP450s家族，是二噁英类化合物的重要代谢酶。本研究在染毒组小鼠子宫内膜异位病灶中检测到CYP1A1蛋白及mRNA表达，CYP1A1蛋白位于小鼠子宫内膜腺上皮细胞的胞浆。随TCDD染毒剂量的增加，CYP1A1蛋白及mRNA表达水平也相应增加，而对照组小鼠子宫内膜异位病灶中未检测到CYP1A1蛋白及mRNA表达。CYP1A基因在组成表达转录中是一个“沉默”的基因，几乎检测不出其组成表达，但极易被TCDD诱导表达而发挥其解毒功能。且随着TCDD剂量的增加，CYP1A1表达随之增加。因此，CYP1A1的诱导表达常被认为是二■英暴露，AhR信号激活的生化指标[14]。CYP1A1参与雌激素的合成和代谢，可催化17β-雌二醇转化成羟雌(甾)二醇。EMS的雌激素依赖性特点使学者推测二■英可能通过调节该基因表达而参与EMS发病。研究发现CYP1A1转录水平在人EMS患者的异位子宫内膜组织中较正常子宫内膜组织升高约8.7倍[15]。
本实验同时发现随着TCDD暴露时间的延长，CYP1A1表达并无明显增加。该结论似乎与前述结论相悖，但从实验模型的设计上我们不难理解。本实验设计染毒时间为每隔21 d染毒一次，虽然TCDD在人体内半衰期较长，约7 ～ 9年;但TCDD在小鼠体内清除半衰期较短，平均为24 d[4]。TCDD在小鼠体内不会产生累加效应，故而基于本实验设计，CYP1A1表达仅与剂量相关，而与暴露时间无明显相关。
3.4 展 望
由于小鼠模型与灵长类动物模型不同，其无自发性月经产生，故本实验中主要反映的是TCDD在EMS发展中影响，TCDD在EMS发生中作用仍需通过大样本和更严谨的实验设计去进一步验证。此外，虽然动物模型的实验结果尚无法类推到人体中TCDD对EMS影响的具体状态，但流行病学研究及实验研究提示TCDD与EMS的发病有相关性，足以警示关注环境激素对人类生殖系统疾病的影响并作深入研究。
参考文献
Porpora MG， Medda E， Abballe A， et al. Endometriosis and organochlorinated environmental pollutants： a case-control study on italian women of reproductive age[J]. Environ Health Perspect， 2009， 117(7)： 1070-1075.
Guo SW. The association of endometriosis risk and genetic polymorphisms involving dioxin detoxification enzymes： A systematic review [J]. Euro J Obst Gynecol Reprod Biol， 2006， 124(2)： 134-143.
Kim EY， Iwata H， Suda T， et al. Aryl hydrocar-bonreceptor (AHR) and AHR nuclear translocator (ARNT) expression in Baikal seal (Pusasibirica) and association with 2，3，7，8-TCDD toxic equivalents and CYP1 expression levels[J]. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol， 2005， 141(3)： 281-291.
Cummings AM， Metcalf JL， Birnbaum L. Promotion of endometriosis by 2，3，7，8- tetrachloro- dibenzo-p-dioxin in rats and mice： time-dose dependence and species comparison [J]. Toxicol Appl Pharmacol， 1996， 138(1)： 131-139.
刘 娟，任慕兰. 二 ■ 英对小鼠模型子宫内膜异位症的影响 [J]. 中国妇幼健康研究，2009，20(2)：161-163.
Becker CM， Wright RD， Satchi FR. A novel noninvasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy [J]. Am J Pathol， 2006， 168(6)： 2074-2084.
De Felip E， Porpora MG， di Domenico A， et al. Dioxin-like compounds and endometriosis： A studyon Italian and Belgian women of reproductive age[J]. Toxicol Lett， 2004， 150(2)： 203-209.
Heilier JF， Nackers F， Verougstraete V， et al. Increased dioxin-like compounds in the serum of women with peritoneal endometriosis and deep endometriotic (adenomyotic) nodules [J]. Fertil Steril， 2005， 84(2)： 305-312.
Yang JZ， Agarwal SK， Foster WG， et al. Subchronic exposure to 2， 3， 7， 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin modulates the pathophysiology of endometriosis in the cynomolgus monkey [J]. Toxicol Sci， 2000， 56(2)， 374-381.
Tsukino H， Hanaoka T， Sasaki H. Associations between serum levels of selected organochlorine compounds and endometriosis in infertile Japanese women [J]. Environ Res， 2005， 99(1)： 118-125.
Bruner-Tran KL， Yeaman GR， Crispens MA， et al. Dioxin may promote inflammation-related development of endometriosis [J]. Fertil Steril， 2008， 89(5 Suppl)：1287-1298.
Kerkvliet NI. Recent advances in understanding the mechanisms of TCDD immunotoxicity[J]. Int Immuno-pharmacol， 2002， 2(2-3)： 277-291.
Buchanan DL， Sato T， Peterson RE， et al. Antiestrogenic Effects of 2，3，7，8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin in Mouse Uterus： Critical Role of the Aryl Hydrocarbon Receptor in Stromal Tissue[J]. Toxicol Sci， 2000， 57(2)： 302-311.
Opera?觡a TN， Nguyen N， Chen S， et al. Human CYP1A1GFP expression in transgenic mice serves as a biomarker for environmental toxicant exposure[J]. Toxicol Sci， 2007， 95(1)： 98-107.
Bulun SE， Zeitoun KM， Kilic G. Expression of dioxin-related transactivating factors and target genes in human eutopic endometrial and endometriotic tissues[J]. Am J Obstet Gynecol， 2000， 182(4)： 767-775.