作者：沈宁， 甘小亮， 黑子清， 庞红宇， 罗刚健
【摘要】 【目的】 观察异丙酚对沙土鼠全脑缺血再灌注后脑保护作用。【方法】 27只雄性清洁级蒙古沙土鼠，随机分为对照组、模型组、异丙酚组，每组9例。对照组：游离双侧颈总动脉但不阻断脑血流。模型组： 游离双侧颈总动脉并阻断脑血流，10 min后开放动脉，2 h后取材。异丙酚组：在开放动脉后即经舌静脉以Grassby3000微量泵持续以10 mg·kg-1·h-1的速度输注异丙酚，2 h后取材。实验结束后，处死动物取脑组织分别固定后行HE染色光镜观察，免疫组化SP染色类胰蛋白酶表达观察，透射电镜观察超微结构，脑含水量测定，脑组织匀浆测定MDA含量、SOD活性、TNF-α和IL-1β含量。【结果】 模型组和异丙酚组脑组织含水量高于对照组(P &< 0.05)，异丙酚组低于模型组(P &< 0.05)。光镜下及电镜下模型组脑组织损伤严重，异丙酚组损伤较轻，对照组脑组织结构基本正常 。三组中， MDA含量、TNF-α浓度、IL-1β含量、类胰蛋白酶表达以模型组最高(P &< 0.05)。SOD活性以模型组最低(P &< 0.05)。 【结论】 异丙酚对沙土鼠全脑缺血再灌注后有明显的脑保护作用，其机理与抗氧化及抑制炎性因子释放相关，而肥大细胞也可能参与了脑缺血再灌注损伤。
【关键词】 异丙酚; 脑; 缺血再灌注; 类胰蛋白酶
Abstract： 【Objective】 This study was designed to observe the protective effects of propofol on global cerebral ischemia-reperfusion injury and changes of malondialdehyde (MDA)， superoxide dismutase (SOD) activity， tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)， interleukin-1beta (IL-1β) and the expression of tryptase in brain of gerbils. 【Methods】 Twenty-seven healthy gerbils (55-70 g)， were randomly pided into three groups： control group (n = 8， sham operation having surgical procedures without bilateral carotid arteries occlusion)， model group (n = 8， having surgical procedures with bilateral carotid arteries occlusion)， propofol group (n = 8， having the same surgical procedures with bilateral carotid arteries occlusion， and propofol i.v. by Grassby 3000 syringe pump with the speed of 10 mg/kg/h via lingual vein). The animals were then killed and the thalamus opticus were removed as soon as the experiment was over. The thalamus opticus was fixed by formaldehyde. HE dyeing before observation under light microscope and use of immunohistochemistry method with SP dyeing to observe the expression of tryptase. The surplus left brain tissue were made into tissue homogenate and preserved at -40℃ to determine the content of MDA， SOD activity， TNF-α， and IL-1β. The right brain tissues were got wet weight and dry weight respectively to calculate the moisture capacity of brain with Eliot formula. Furthermore， we take an animal from three groups respectively to observe the ultramicrostructure of brain by electron microscopy. 【Results】 Moisture capacity of brain of model group was the highest among three groups while that of propofol group is less than model group (P &< 0.05). The outcomes of light microscope showed that damage of brain tissue of model group was most severe among the three groups and the contents of MDA， TNF-α， IL-1β and tryptase of model group was also highest as well. Contents of MDA of propofol group decreased obviously compared with model group. The SOD activity was the lowest in the model group. 【Conclusion】 Propofol can protect ischemia-reperfusion injury in brain by antioxygen and refraining inflammatory factors and mast cell perhaps play an important role during the development of ischemia-reperfusion injury.
脑缺血再灌注时，肥大细胞存在大量活化现象，脑缺血后肥大细胞出现脱颗粒现象可能在脑缺血再灌注损伤中起了重要作用，而脱颗粒释放的炎症介质又可进一步加重组织的炎症反应，形成恶性循环[1]。因此，我们设想：在脑缺血-再灌注过程中肥大细胞活化可能是导致脑损伤加重的重要环节之一。异丙酚是临床十分常用的麻醉镇静药[2-3]，有研究显示异丙酚具有一定的脑保护作用[4]。另外，一些学者观察到异丙酚对肥大细胞活化和脱颗粒有抑制作用，但用异丙酚在脑缺血-再灌注过程中来干预这一环节进行防治的研究尚未见文献报道。本实验旨在进一步研究异丙酚干预沙土鼠脑缺血再灌注后氧化产物、炎性细胞因子及脑内肥大细胞标志物类胰蛋白酶变化，并通过对缺血脑组织光镜及超微结构的观察，进一步说明异丙酚对脑缺血再灌注损伤有保护作用，为异丙酚在临床上的进一步应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 动物分组
健康，雄性清洁级蒙古沙土鼠27只，体质量55 ～ 70 g，由浙江省实验动物中心提供，合格证号：0001382。在实验前均在卫生的环境中饲养，自由摄食、饮水。沙土鼠随机分为：对照组(control)，游离双侧颈总动脉但不阻断脑血流。模型组(model)： 游离双侧颈总动脉并阻断脑血流，10 min后开放动脉，2 h后取材。异丙酚组(propofol)：在开放动脉后即经舌静脉以Grassby3000微量泵持续以10 mg·kg-1·h-1的速度输注异丙酚(AstraZeneca，Italy) 2 h后取材。
1.2 动物模型建立
30 g/L戊巴比妥钠45 mg·kg-1腹腔注射麻醉，将动物仰卧在实验台上，剪开颈部正中皮肤，分离双侧颈总动脉、套线，然后用微动脉夹同时阻断双侧颈总动脉血流造成脑缺血，检查远端血流情况以确保完全阻断血流。脑缺血时间为10 min，松开动脉夹恢复脑血流即为再灌注。对照组仅游离双侧颈总动脉但不阻断脑血流。
1.3 标本处理
断头处死动物(每组8只)，快速取出脑组织并取丘脑约1 cm3， 40 g/L多聚甲醛溶液固定，病理切片，HE染色光镜观察及免疫组化SP染色类胰蛋白酶表达，剩余脑组织正中矢状切分左右大脑，左侧制成组织匀浆，-40 ℃保存，测定MDA、SOD、TNF-α、IL1-β。右侧脑组织取出后迅速吸尽表面水份，用于脑含水量的测定。另取模型组、对照组、异丙酚组动物各一只，运用左心室灌注固定取材方法，于左心室处注入25 g/L戊二醛(sigma，USA)约100 mL，将其全身灌注固定，冰皿上断头从丘脑区同一部位取材，体积约1 mm3大小，立即放入25 g/L戊二醛缓冲液中固定4 h，用10 g/L锇酸(sigma，USA)作用2 h，梯度酒精脱水，Epon812包埋，超薄切片，经电子染色，用H-600透射电镜(HITACHI，JAPAN)观察超微结构。
1.4 观察指标
在光镜下(LEICA，GERMANY)观察脑组织病理损伤情况。透射电镜下(H-600 HITACHI，JAPAN)观察超微结构变化。右侧脑组织用分析天平称取湿质量后放入105 ℃恒温烤箱，烘烤48 h后称取干质量，计算脑组织含水量(用Eliot公式计算，含水量(%) = (湿质量-干质量)/湿质量 × 100%)。采用硫代巴比妥酸反应法测定MDA含量。黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。采用ELISA方法测定TNF-α含量和IL-1β含量。丘脑组织免疫组化SP染色肥大细胞类胰蛋白酶表达、计数。
1.5 统计学处理
计量资料以均数 ± 标准差(x ± s)表示，采用方差分析比较各组的差异。取α = 0.05。
2 结 果
2.1 丘脑组织HE染色病理学结果
对照组：脑组织均匀，神经元排列整齐、致密，胞核无固缩、变形，胞浆无水肿;异丙酚组：脑组织损伤较轻，大部分神经元结构基本正常，少数神经元胞核固缩，胞浆水肿;模型组：脑组织损伤明显，出现大片液化坏死区域，神经元坏死性变性，胞核固化、溶解、消失，细胞周边呈扇形空泡改变(图1)。
2.2 丘脑组织超微结构变化
对照组：神经元结构清晰，胞核及胞浆结构正常，线粒体无肿胀，嵴清晰。异丙酚组：神经元结构基本正常，胞核无固缩，线粒体稍肿胀，嵴稍模糊，管周稍水肿;模型组：胶质细胞破裂、溶解，周围神经毡肿胀，神经元胞核固缩，线粒体肿胀，嵴消失，管周水肿(图2)。
2.2 脑组织含水量.
脑组织含水量模型组显著升高(P &< 0.05)，异丙酚组低于模型组和高于对照组(P &< 0.05;表1)。
2.3 脑组织SOD活性和MDA含量
三组中， SOD活性以模型组最低(P &< 0.05)，异丙酚组与对照组相比，SOD活性无统计学意义(P &> 0.05)，MDA含量以模型组最高(P &< 0.05)，对照组最低(P &< 0.05，表1)。
2.4 脑组织TNF-α、IL-1β含量变化
与对照组比较，模型组TNF-α浓度明显升高(P &< 0.05);与模型组相比，异丙酚组TNF-α浓度明显降低(P &< 0.05);脑组织IL-1含量变化，与对照组比较，模型组IL-1含量升高(P &< 0.05);与模型组相比，异丙酚组IL-1含量数值明显下降(P &< 0.05;表1)。
2.5 肥大细胞类胰蛋白酶表达变化
各组肥大细胞类胰蛋白酶表达计数分别为：对照组：102 ± 5，模型组：247 ± 8，异丙酚组：157 ± 5，与对照组相比，模型组肥大细胞类胰蛋白酶表达明显升高(P &< 0.05)，类胰蛋白酶多量表达;与模型组比较，异丙酚组明显降低(P &< 0.05)，类胰蛋白酶少量表达(图3)。
3 讨 论
沙土鼠具有独特的脑血管解剖特征，连接其颈内动脉系统和椎底动脉系统的脑底动脉环后交通支先天缺损或发育不全，不能构成完整的Willis动脉环，因此，阻断双侧颈总动脉即可复制全脑缺血再灌注损伤模型。氧化损伤是引起缺血再灌注损伤的重要机制之一[5-8]，丙二醛(MDA)是氧化损伤过程中脂质过氧化的产物;超氧化物岐化酶(SOD)能清除氧自由基，其活性反映了机体抗氧化损伤的能力[9]。Ding等[10]在大鼠脑缺血再灌注损伤模型研究发现，MDA含量的增加和SOD活性降低与脑梗死面积和再灌注后脑组织损伤的程度密切相关。另外，许多研究发现[11-12]，脑缺血后神经组织中TNF-α mRNA 及IL-1β mRNA 的表达明显增加，血清中TNF-α和IL-1β 的含量明显升高，参与了脑组织的损伤，虽然二者升高的时间和程度不尽一致，但均显示与脑缺血再灌注损伤的直接相关。通过复制沙土鼠全脑缺血再灌注损伤模型，我们发现：模型组脑组织病理性损伤十分显著，出现大片液化坏死区域，神经元坏死性变性，胞核固化、溶解、消失，细胞周边呈扇形空泡改变，脑含水量显著增高;MDA、TNF-α和IL-1β含量明显高于正常组，而SOD活性显著低于正常组，进一步证实氧化损伤和炎症细胞因子的释放是沙土鼠全脑缺血再灌注损伤的重要机制。
异丙酚(Propofol，2，6一二异丙基酚)是一种新型的静脉麻醉药物。Pilar等[13]通过夹闭及开放主动脉造成的肾缺血再灌注损伤动物模型中，发现异丙酚通过清除自由基，抑制脂质过氧化及减少炎性因子而减轻肾脏损伤。Xia等[14]观察到，在大鼠心脏缺血再灌注过程中，异丙酚输注能减少MDA含量和提高SOD活性，并呈剂量依赖性。另外，Feng等[15]研究发现，异丙酚通过抑制核转录因子NF-kappa β激活而减轻炎性反应，可能是神经保护作用机制之一。夏瑞等[16]亦发现异丙酚能有效抑制IL-1β的合成和释放，Taniguchi等[17]的研究中，注射内毒素后即刻给予异丙酚10 mg·kg-1，然后持续以10 mg·kg-1·h-1速度维持，该组的血浆中TNF-a的浓度明显低于其它组，同时该组的肺组织的中性粒细胞的浸润也较其它组轻。在本次试验中，我们发现：异丙酚能显著减轻缺血再灌注脑组织损伤程度，多数神经元结构基本正常;MDA、TNF-α和IL-1β含量明显低于模型组，而SOD活性明显高于模型组;本研究结果证实异丙酚脑保护作用与其抗氧化作用及抑制炎性细胞因子有关。另外，Silver等[18]发现，脑缺血后产生的炎症反应可以引起肥大细胞脱颗粒，而脱颗粒释放的炎症介质又可以进一步加重组织的炎症反应，形成恶性循环。肥大细胞通过其释放的生物活性胺组胺、5-羟色胺、以及IL-8，TNFa改变血脑屏障的通透性，促使白细胞迁移入脑内，加重炎症反应，引起组织水肿，胡薇薇等[1]研究发现在大鼠全脑缺血5 min再灌注后1 h和7 d后，丘脑肥大细胞数量都出现了显著下降，而此时脱颗粒比例呈明显增加，表明在全脑缺血再灌注损伤后丘脑肥大细胞出现明显的脱颗粒变化。Edston等[19]研究发现脑梗塞区域的边缘有肥大细胞的出现，据此推测，脑内肥大细胞可能与脑缺血再灌注损伤密切相关。脑缺血再灌注后肥大细胞出现脱颗粒现象可能在脑缺血再灌注损伤中起了重要作用。在我们的研究中，模型组肥大细胞标志物类胰蛋白酶表达明显升高(P &< 0.05)，类胰蛋白酶多量表达，而与模型组比较，异丙酚组类胰蛋白酶表达明显降低(P &< 0.05)，类胰蛋白酶少量表达，这在一定程度上证实了脑缺血再灌注后肥大细胞脱颗粒在脑缺血再灌注损伤中起了重要作用，而异丙酚可以抑制肥大细胞脱颗粒，从而产生脑保护作用。
综上所述，异丙酚能通过提高SOD活性，抑制脂质过氧化反应以及减少炎性细胞因子释放，一定程度减轻了沙土鼠全脑缺血再灌注损伤。同时，我们的实验也发现脑缺血再灌注后肥大细胞标志物类胰蛋白酶明显升高，而异丙酚能明显抑制脑缺血再灌注导致的这种肥大细胞活化现象，这说明肥大细胞可能参与了脑缺血再灌注损伤的病理生理过程。在以后的缺血再灌注损伤治疗中， 介入肥大细胞功能可能也是重要的考虑因素，进一步研究肥大细胞在脑缺血后损伤中的作用及其机理，对于防治脑缺血再灌注损伤有重要意义!
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