作者：吴毅梅 江山平 吕志强 张蔚 戴冽 郑东辉
【摘要】 【目的】 观察瞬时感受器电位M7通道(TRPM7)在大鼠肥大细胞系RBL-2H3的表达，探讨其对RBL-2H3增殖和凋亡的影响。【方法】 Western blot及细胞免疫荧光分别检测TRPM7 在RBL-2H3的表达。通过离子通道阻断剂2-APB抑制TRPM7通道的表达，以WST-1法检测细胞增殖，流式细胞术及Hoechst 33342 荧光染色检测细胞凋亡。【结果】 Western blot及细胞免疫荧光法均检测到TRPM7在RBL-2H3的表达，细胞免疫荧光提示TRPM7主要表达于RBL-2H3细胞膜。100 μmol/L和 200 μmol/L的2-APB可明显抑制TRPM7的表达。100 μmol/L和 200 μmol/L的2-APB对RBL-2H3的增殖抑制率分别为(30.4 ± 4.2)%和(42.0 ± 0.8)%，早期凋亡率分别为(36.9 ± 6.7)%和(49.3 ± 1.8)%，总凋亡率分别为(40.2 ± 7.0)%和(76.8 ± 5.5)%。【结论】 TRPM7通道表达于RBL-2H3肥大细胞系并参与其增殖和凋亡。
【关键词】 肥大细胞; 凋亡; 瞬时感受器电位M7通道
Abstract： 【Objective】 To investigate the expression of transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7) and its role in proliferation and apoptosis in rat basophilic leukemia cell line (RBL-2H3). 【Methods】 Expression of TRPM7 in RBL-2H3 were detected by Western blot and immunofluorescence. TRPM7 channels were inhibited by specific ion channel inhibitor 2-APB. Cell proliferation was assessed by WST-1. Cell apoptosis was evaluated by flow cytometry and Hoechst 33342 staining. 【Results】 TRPM7 was expressed in RBL-2H3 observed by Western blot and immunofluorescence， and it was located mainly along the membrane. The application of 2-APB(100 μmol/L and 200 μmol/L) could significantly inhibit TRPM7 protein expression. The inhibition rates of proliferation by 100 μmol/L and 200 μmol/L 2-APB were (30.4 ± 4.2)% and (42.0 ± 0.8)%， respectively， while the early apoptosis rates were (36.9 ± 6.7)% and (49.3 ± 1.8)%， and total apoptosis rates were (40.2 ± 7.0)% and (76.8 ± 5.5)%，respectively. 【Conclusions】 TRPM7 channel was expressed in RBL-2H3 and played a role in its proliferation and apoptosis.
肥大细胞是支气管哮喘的主要免疫效应细胞，钙离子在肥大细胞一系列Ca2+ 依赖性生理活动包括基因转录、细胞增殖和凋亡、炎症介质的释放等发挥重要作用。肥大细胞的钙离子通道的分子生物学特性至今尚未完全明确。作为非兴奋性细胞，受体操纵性通道是肥大细胞介导钙离子内流的重要通道，而瞬时电位通道(transient receptor potential， TRP)作为受体操纵性通道的首要候选通道则是近年来研究的热点[1]。瞬时感受器电位M7(transient receptor potential melastatin 7，TRPM7)是TRP的重要成员，已有报道它参与了淋巴细胞的增殖过程[2]，但是有关肥大细胞上瞬时感受器电位M7的研究目前国内未见报道。
由于原代肥大细胞生长缓慢、培养成本昂贵，使肥大细胞的研究受到限制[3]。大鼠嗜碱性白血病细胞(rat basophilic leukemia cells，RBL-2H3)是美国Barsumians研究小组将大鼠嗜碱性白血病细胞株反复克隆所得，能模拟粘膜型肥大细胞的多种功能[4]，由于其培养较易，功能与粘膜型肥大细胞相似，被广泛应用于与肥大细胞有关的各种生理、病理、药物作用机制等的体外研究[5-7]。
本研究选择大鼠RBL-2H3细胞作为研究对象，通过检测RBL-2H3细胞TRPM7通道的表达及观察其受抑制后细胞增殖及凋亡功能的改变，初步探讨TRPM7对RBL-2H3细胞增殖及凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞系及主要试剂
RBL-2H3细胞购于中国科学院上海细胞库，来源于美国ATCC(American Type Culture Collection)。DMEM(高糖)培养基和胎牛血清均为Hyclone公司产品。胰酶购自广州威佳公司。离子通道阻断剂2-APB购于Merck公司。Hoechst 33342、细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(WST-1 Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)、Cy3标记驴抗山羊IgG为上海碧云天公司产品。Annex V-FITC/ PI双染凋亡检测试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。蛋白浓度测定试剂盒购自上海博彩生物科技有限公司。辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG、山羊抗大鼠TRPM7多克隆抗体购自Abcam公司。
1.2 细胞培养
RBL-2H3细胞常规复苏、传代，以含100 mL/L胎牛血清的DMEM高糖培养基在37 ℃、体积分数为5% CO2的细胞培养箱培养。2 d传代一次，取对数生长的细胞进行实验。
1.3 TRPM7蛋白的Western blot检测
收集不同2-APB(终浓度分别为50、100、200 μmol/L)作用72 h的RBL-2H3细胞，用细胞裂解液处理，离心后取上清，采用 BCA(bicinchoninic acid)法行蛋白定量， 采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，通过电转移法将蛋白转移至PVDF滤膜上，用封闭液封闭后，与1：250山羊抗大鼠TRPM7多克隆抗体4 ℃ 过夜，再与 1 ∶ 5 000 的HRP标记的辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG室温孵育2 h，ECL显色，暗室胶片曝光，采用GAPDH作为内参照，重复至少3次。
1.4 TRPM7蛋白的间接免疫荧光检测
取对数生长期细胞制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为5 × 103/mL，接种于24孔板，每孔接种1 mL，过夜贴壁。PBS洗2次后以40 g/L多聚甲醛室温固定10 min。PBS洗3次，30 g/L BSA封闭1 h后，与1 ∶ 100山羊抗大鼠TRPM7多克隆抗体4 ℃ 过夜，再与Cy3标记驴抗山羊IgG避光孵育2 h。1 μg/mL Hoechst 33342染色液染核5 min，PBS洗3次后在荧光显微镜下观察并拍照。
1.5 细胞增殖的检测
取对数生长期细胞制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为105/mL 接种于 96 孔板，每孔接种 100 μL，培养至少3 h待细胞贴壁后加入2-APB，使其终浓度分别为50、100、200 μmol/L，设相应的溶剂对照和不加药的正常对照，并设未加细胞的培养液孔作为调零孔。每孔的终体积均为200 μL。于加药培养72 h后，每孔吸弃100 μL培养液，加入WST-1试剂10 μL继续孵育1 h后，酶联仪450 nm测定每孔吸光度值。每种药物浓度至少做3个复孔，重复至少3 次。生长抑制率 = [1-(处理组/正常对照组)) × 100%。
1.6 细胞凋亡检测
分别采用采用流式细胞术和Hoechst 33342 荧光染色检测细胞凋亡。其中流式细胞术通过AnnexinⅤ/FITC和PI双染法进行检测：调整细胞浓度为2 ～ 4 × 105/mL接种于24孔板，每孔接种1 mL，培养至少3 h待细胞贴壁后加入2-APB，使其终浓度分别为100 μmol/L和200 μmol/L，设相应的溶剂对照和不加药的正常对照， 培养72 h后用预冷的PBS洗细胞1次，胰酶消化细胞后再用PBS洗1次，分别加入AnnexinⅤ/FITC和PI，室温避光孵育后上流式细胞仪检测。Hoechst 33342 荧光染色则在细胞培养72 h后用预冷的PBS洗细胞1次，40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗3次，5 min/次。以1 ug/mL Hoechst 33342染色液避光孵育5 min，冰PBS洗3次后以荧光显微镜检测。
1.7 统计学处理
采用SPSS 13.0软件进行统计分析。实验数据以 x ± s表示。组间数据采用t 检验或秩和检验。
2 结 果
2.1 Western blot和间接免疫荧光检测TRPM7的表达
Western blot检测到220 ku的条带，与预定位置相符(图1A)。间接免疫荧光检测到TRPM7主要表达于RBL-2H3细胞膜(图1B)。
2.2 不同浓度2-APB作用72 h后TRPM7表达的变化
分别取2-APB(终浓度分别为50、100、200 μmol/L)作用72 h后的总蛋白进行Western blot检测，结果表明100 μmol/L和200 μmol/L的2-APB可明显抑制TRPM7的表达(图2)。
2.3 不同浓度2-APB对RBL-2H3增殖的抑制作用
RBL-2H3细胞经过不同浓度的2-APB(终浓度分别为50、100、200 μmol/L)作用72 h后，细胞数减少，50 μmol/L处理组细胞生长抑制率为(9.7 ± 5.8)%，100 μmol/L处理组细胞生长抑制率为(30.4 ± 4.2)%，200 μmol/L处理组细胞生长抑制率为(42.0 ± 0.8)%，100 μmol/L及200 μmol/L处理组较对照组均降低(P &< 0.05)。以上重复4 次(图3)。
2.4 不同浓度2-APB对RBL-2H3凋亡的促进作用
以流式细胞术检测RBL-2H3细胞经过100 μmol/L和200 μmol/L 2-APB作用72 h后凋亡率的改变，结果显示早期凋亡率和总凋亡率均增加(P &< 0.05，表1，图4，5A)。Hoechst 33342 荧光染色结果显示，对照组细胞数明显多于2-APB处理组，且界限清晰，胞核染色质均匀分布，少见强荧光的胞核;100 μmol/L处理组细胞72 h后，细胞变圆，体积缩小，核呈强荧光的凋亡细胞明显多于对照组;200 μmol/L处理组细胞体积缩小，胞核缩小，呈强蓝色荧光，可见染色质浓缩呈斑块状，出现凋亡小体(图5B)。
3 讨 论
作为细胞内的重要信使，细胞内Ca2+ 的变化是影响细胞生理功能的重要因素，也是多种受体激活后信号转导过程中的关键。瞬时感受器电位通道是一类位于细胞膜上的阳离子通道，主要包含TRPC 家族、TRPV 家族、 TRPM 家族、TRPP 家族、TRPN 家族、TRPA家族、TRPML 家族共7 个亚家族，其中TRPC、TRPV、TRPM 主要与钙离子转运有关[8]。TRPM7 是TRPM 亚家族的成员之一，同时具有离子通道和激酶结构域的双向功能，其基因编码一个持续性开放的受细胞内Mg2+/ATP 调节的钙通道，可介导钙离子和镁离子内流[9]。研究表明TRPM7在脑、心、肾、肝中均有表达，但是否表达于肥大细胞及其功能如何目前报道尚不多见。
不同部位的肥大细胞其形态、介质释放和对抗原的敏感性均有一定差异。根据它们的颗粒成分、对脱颗粒物质的敏感性以及表面IgE受体的数目，主要可分为粘膜型和浆膜型两种肥大细胞，而肺中2/3的肥大细胞为粘膜型[4]。RBL-2H3细胞能模拟粘膜型肥大细胞的多种功能，是体外研究与肥大细胞有关的各种生理、病理、药物作用机制等的重要模型。对RBL-2H3细胞的Western blot和间接免疫荧光检测表明，TRPM7表达于RBL-2H3细胞并且主要分布于细胞膜。
TRPM7的功能目前尚未完全明确，已有研究表明它在细胞膜生理电位水平(-100 ～ 40 mV)时，通道激活后能产生一主要由单价阳离子组成的较小的内向电流，膜电位在 +100 mV 时，产生主要由二价阳离子组成的较大的外向电流[10]。目前认为TRPM7通道主要与钙镁离子自稳平衡、缺血诱导性神经元死亡、对二价阳离子如锌、锰的通透性使上述微量元素进入细胞以及细胞增殖和存活有关[10-12]。为此本实验采用TRP通道阻断剂2-APB处理RBL-2H3细胞，通过Western blot观察2-APB处理后RBL-2H3细胞TRPM7通道表达的改变。结果显示，100 μmol/L和200 μmol/L的2-APB可明显下调TRPM7的表达。以100 μmol/L和200 μmol/L的2-APB处理RBL-2H3细胞72 h后，细胞的增殖受到明显抑制，凋亡率增加。与本研究结果类似，Sahni等研究发现消除DT-40 B 淋巴细胞的TRPM7 立即引起细胞成长停止和死亡，显示TRPM7 引起的钙流入对该细胞的存活起关键作用[2]。Abed报道人成骨细胞在细胞外镁离子浓度降低时可诱发钙离子和镁离子的内流，而沉默TRPM7基因后则可使钙离子和镁离子内流减少并导致细胞增殖受抑制[13]。Kim研究小组则发现人胃癌细胞TRPM7的表达与细胞增殖及凋亡均有关[14]。但是有关TRPM7参与细胞凋亡的机制目前仍待进一步研究。
因此，本实验结果表明，TRPM7通道表达于大鼠RBL-2H3细胞并参与细胞增殖及凋亡的过程。与以往常用的钙离子拮抗剂主要针对电压操纵性钙通道不同，2-APB主要作用于受体操纵性通道，它对RBL-2H3细胞的生长抑制以及促凋亡的明显作用提示TRPM7通道可能为调控肥大细胞增殖及凋亡的重要靶点。
参考文献
史 娟，李继硕. TRP离子通道 [J]. 神经解剖学杂志， 2004， 20(2)： 197-204.
Sahni J， Scharenberg AM. TRPM7 ion channels are required for sustained phosphoinositide 3-kinase signaling in lymphocytes [J]. Cell Metabolism， 2008， 8(1)： 84-93.
Passante E， Ehrhardt C， Sheridan H， et al. RBL-2H3 cells are an imprecise model for mast cell mediator release [J]. Inflamm Res， 2009， 58(9)： 611-618.
Lloyd HG， Ross L， Li KM， et al. Evidence that IgE receptor stimulation increases adenosine release from rat basophilic leukaemia (RBL-2H3) cells [J]. Pulm Pharmacol Ther， 1998， 11(1)： 41-46.
Sada K， Miah SM， Maeno K， et al. Regulation of FcepsilonRI-mediated degranulation by an adaptor protein 3BP2 in rat basophilic leukemia RBL-2H3 cells[J]. Blood， 2002， 100(6)： 2138-2144.
Schindl R， Kahr H， Graz I， et al. Store depletion-activated CaT1 currents in rat basophilic leukemia mast cells are inhibited by 2-aminoethoxydiphenyl borate. Evidence for a regulatory component that controls activation of both CaT1 and CRAC (Ca(2+) release-activated Ca(2+) channel) channels [J]. J Biol Chem， 2002， 277(30)： 26950-26958.
Jolly PS， Bektas M， Watterson KR， et al. Expression of SphK1 impairs degranulation and motility of RBL-2H3 mast cells by desensitizing S1P receptors[J]. Blood， 2005， 105(12)： 4736-4742.
Fleig A ，Penner R. The TRPM ion channel subfamily： molecular， biophysical and functional features[J]. Trends Pharmacol Sci， 2004， 25(12)： 633-639.
Schlingmann KP， Waldegger S， Konrad M， et al. TRPM6 and TRPM7——Gatekeepers of human magnesium metabolism [J]. Biochim Biophys Acta， 2007， 1772(8)： 813-821.
Nadler MJ， Hermosura MC， Inabe K， et al. LTRPC7 is a Mg. ATP-regulated palent cation channel required for cell viability [J]. Nature， 2001， 411(6837)： 590-595.
Abed E， Moreau R. Role of melastatin-like transient receptor potential 7 [TRPM7] channel in calcium influx and proliferation of human osteoblast-like cells[J]. Bone， 2007， 40(6)： 273-275.
Aarts M， Iihara K， Wei WL， et al. A key role for TRPM7 channels in anoxic neuronal death[J]. Cell， 2003， 115(7)： 863-877.
Abed E and Moreau R. Importance of melastatin-like transient receptor potential 7 and cations (magnesium， calcium) in human osteoblast-like cell proliferation [J]. Cell Proliferation， 2007， 40(6)： 849-865.
Kim BJ， Park EJ， Lee JH， et al. Suppression of transient receptor potential melastatin 7 channel induces cell death in gastric cancer [J]. Cancer Science， 2008， 99(12)： 2502-2509.