作者：蒋卫平，丁茂文，朱亚非，李冰，朱晚林，李欣华，林菲菲
【摘要】 目的 ：建立实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(real-time fluorescence quantitative RT-PCR)检测人外周血单个核细胞中FOXP3 mRNA的方法，并研究其与CD4+CD25+Treg细胞活性相关性。方法： 提取人外周血单个核细胞总RNA，将mRNA逆转录成cDNA，以β-actin为内参照，实时荧光定量RT-PCR检测29例哮喘患儿及24例同龄对照FOXP3 mRNA的相对表达量，采用融解曲线和琼脂糖电泳鉴定PCR产物特异性；同时采用流式细胞技术检测CD4+CD25+Treg细胞含量，分析两者相关性。结果：哮喘患儿组CD4+CD25+Treg细胞百分率明显低于同龄对照组，P＜0.01；FOXP3 mRNA的表达也显著降低，P＜0.05；FOXP3和β-actin的融解曲线分析表明均仅有单一峰，Tm值分别为82.4 ℃和87.8 ℃；琼脂糖电泳显示都仅有单一扩增产物。结论：应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术检测FOXP3 mRNA表达水平简便易行、结果稳定可靠。初步结果证实，外周血CD4+CD25+Treg细胞数量和FOXP3 mRNA表达有相同的趋势，存在一定的相关性。
【关键词】 实时荧光定量RT-PCR；哮喘；FOXP3；CD4+CD25+调节性T细胞
Abstract: Objective: To establish a real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）to detect FOXP3 mRNA expression in human peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） and to investigate the correlations between activity of CD4+CD25+ regulatory T cells and expression of FOXP3 mRNA. Methods: Total RNA was extracted with Trizol from human PBMCs and mRNA was transcribed reversely into cDNA. Real-time fluorescent quantitative RT-PCR with β-actin as the internal control gene was used to detect the expression levels of FOXP3 mRNA in 29 pediatric patients with asthma and 24 age-matched healthy children. The specificity of PCR productions was identified with the dissociation curves and agarose gel electrophoresis. Flow cytometry analysis was used to assess the percentage of CD4+CD25+regulatory T cells. The correlation between the expression and activity was analyzed. Results: The percentages of CD4+CD25+ regulatory T cells in group of asthma were significantly lower than those in group of control (P &<0.01)， so did the expressions of FOXP3 mRNA (P &<0.05). The analysis of dissociation curves on FOXP3 and β-actin showed that both of them had only one simple spike and the Tm values were 82.4 ℃ and 87.8 ℃，respectively. The agarose gel electrophoresis of them showed only single PCR product each. Conclusion: It is an easy and reliable test to detect the expression level of FOXP3 mRNA by SYBR GreenⅠreal-time fluorescence quantitative RT-PCR and the preliminary experimental result shows that the percentages of CD4+CD25+ regulatory T cells and the expressions of FOXP3 mRNA have the same trend and confirms the correlation between them.
Key words: real-time fluorescence quantitative RT-PCR；asthma；forkhead/winged helix transcription factor；CD4+CD25+regulatory T cells
CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）是具有免疫抑制功能的一群T细胞，在维持机体免疫自稳、免疫耐受和防止自身免疫性疾病的发生方面具有十
分重要的作用，叉状头/翅膀状螺旋转录因子（forkhead/winged helix transcription factor，FOXP3）特异地高表达于CD4+CD25+Treg，介导CD4+CD25+Treg在胸腺的发育、外周的表达及功能的维持，可反映CD4+CD25+Treg活性水平[1-3]。支气管哮喘（以下简称哮喘）是淋巴细胞、嗜酸性粒细胞（eosinophils，EOS）和肥大细胞等多种炎性细胞、炎症介质和细胞因子参与的气道慢性炎症性疾病，其发病过程与效应性CD4+T细胞尤其是Ⅱ型辅助性T细胞（Th3）活化并分泌多种细胞因子密切相关；CD4+CD25+Treg可能通过其免疫抑制功能抑制Th3细胞的活化而阻止哮喘的发生和发展[4]。本实验建立了SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测人外周血单个核细胞中FOXP3 mRNA的表达，并验证了其与流式细胞术检测CD4+CD25+Treg表达的相关性，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源：2008年2月至5月在我院小儿科就诊的29例哮喘患儿（病程2～8年）及24例正常对照共计53例，年龄3～14岁，平均（6±2）岁，其中男32例，女21例，患儿诊断均符合中华医学会儿科学会呼吸组制定的哮喘诊断标准[5]，正常同龄对照组均为无过敏性疾病史的健康儿童；分别采取两管EDTA抗凝的静脉血2 mL，及时送检。
1.1.2 主要仪器：BD FACSCalibur流式细胞仪，罗氏LightCycler荧光PCR仪，电泳分析系统及凝胶成像系统。
1.1.3 试剂：多甲藻素叶绿素蛋白（PerCP）标记的CD45单克隆抗体（McAb）、人异硫氰酸荧光（FITC）标记的CD4McAb、藻红蛋白（PE）标记的CD25McAb 均购自美国BD PharMingen公司；淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司；总RNA提取试剂盒Trizol、第一链cDNA合成试剂盒、热启动荧光定量PCR核心试剂盒（SYBR Green I染料法）均购自上海闪晶分子生物科技有限公司；引物序列由上海闪晶分子生物科技有限公司合成纯化。
1.2 方法
1.2.1 流式细胞仪检测外周血单个核细胞(PBMCs)中CD4+CD25+Treg的比例：分别加入6μL PerCP标记的CD45McAb、10μL FITC标记的CD4 McAb和PE标记的CD25 McAb于50μL的EDTA抗凝血中，避光孵育15 min，加入溶血素，避光溶血10分钟，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤1次，1 200 r/min离心5 min，弃上清，再用500μL PBS重悬细胞，上流式细胞仪（BD公司）检测，结果用CellQuest软件处理。
1.2.2 引物设计：根据GeneBank提供的FOXP3 mRNA 序列(GeneBank号：AF277993)和β-actin 序列(GeneBank号：AY399813)设计引物。目的基因FOXP3引物：上游（5’to3’）F：CTGACCAAGGCT TCATCTGTG，下游（5’to3’）R：ACTCTGGGAATGTGC TGTTTC，扩增片段长度为176 bp，内参基因β-actin引物：上游（5’to3’）F：TGACGTGGACATCC GCAAAG，下游（5’to3’）R：CTGGAAGGTGGACA GCGAGG，扩增片段长度为205 bp。
1.2.3 淋巴细胞分离：取2 mL的EDTA抗凝血加2 mL淋巴细胞分离液，颠倒混匀，然后在2 000 r/min离心20 min。
1.2.4 总RNA提取：①小心吸取上述分离的中间层白细胞（单个核细胞）放入1.5 mL离心管（RNase-Free）中，然后加入1mL Trizol，颠倒混匀后，室温放置5 min，使其充分裂解，最后放入-80 ℃冰箱保存备用。②将所有冰箱里的标本取出室温解冻后，12 000 r/min离心5 min，弃沉淀。③加入200μL氯仿（4 ℃预冷），颠倒混匀后室温放置15 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。④吸取上层水相至另一离心管（RNase-Free）中，加入0.5 mL异丙醇（-20 ℃预冷）颠倒混匀数次，室温放置5～10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，RNA沉于管底。⑤加入75%乙醇（-20 ℃预冷），温和振荡离心管，悬浮沉淀，4 ℃ 8 000 r/min离心5 min，尽量弃上清。⑥室温晾干或真空干燥5～10 min，最后加入50μL DEPC处理的h3O，适当混匀，稍事离心备用。
1.2.5 逆转录：①取上述RNA提取物8μL加入1μL Oligo(dT)18primer，小心混匀，65 ℃保温5 min，室温放置10 min，室温高速离心5 s，将所有溶液收集到管底。②按次序分别加入下列试剂：2×First-Strand Buffer 10μL，RT-mix 1μL，总体积为20μL。小心混匀稍事离心，42 ℃50 min，然后90 ℃处理5 min，冰上冷却，室温高速离心5 s，将所有溶液收集到管底，-20 ℃保存备用。
1.2.6 荧光定量PCR反应体系：①Hot start Fluo-PCR mix：10μL，②上游引物（50 pmol/μL）：0.2μL，③下游引物（50 pmol/μL）：0.2μL，④无菌去离子水：7.6μL，⑤上述逆转录后的cDNA：2μL；一个反应体系的总体积为20μL。
扩增条件设置 ①93 ℃预变性2 min；②93 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环，每个循环延伸后收集一次荧光，分析模式设定为定量分析；③93 ℃变性15 sec，72 ℃延伸1 min，最后设定温度93 ℃，温度变化速率为0.1 ℃/sec，连续监测荧光，进行熔解曲线分析。仪器检测通道选择F1通道。
1.2.7 扩增产物电泳分析：①将扩增后的毛细反应管小心开盖倒扣在0.5 mL的离心管中，4 000 r/min离心20 s，将产物全部收集到离心管中。②配1%琼脂糖凝胶，制成电泳胶板（分子克隆实验指南），取5μL扩增产物加1μL loading buffer混匀后上样，在100 V的电压下电泳20 min，最后在凝胶成像系统中拍照成像。
1.2.8 结果计算：用相对定量的研究方法分析实验结果。FOXP3/β-actin比值采用2－△Ct方法计算，△Ct=Ct1－Ct2。
1.2.9 统计学处理方法：经方差齐性检验后，采用t检验比较两组间差异，用简单直线相关分析探讨两因素之间相关性。
2 结果
2.1 荧光定量方法学评价
①特异性FOXP3和β-actin扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，可见约176 bp和205 bp特异性条带出现，与理论上的目的片段长度完全一致，同时进行熔解曲线分析，判断FOXP3和β-actin均只有一尖峰，解链温度（Tm值）分别为82.4 ℃和87.8 ℃，说明分别仅有一扩增产物（见图1～3）。②线性范围与最低检测限定量浓度用Ct值的负对数表示，将逆转录产物cDNA进行10倍倍比稀释，最低检测限为0.637/反应，线性范围为0.637～0.796/反应，相当于Ct值从18到37的跨度，相关系数为0.98。③精密度：取2份浓度高低不同（Ct值为21和35）的标本重复测定4次，测定结果经对数处理后其批内CV值为1.6～2.8%，批间CV值为2.5～6.7%。
2.2 哮喘患儿CD4+CD25+Treg明显下降
29例哮喘患儿与24例正常儿童CD4+CD25+Treg检测结果分别为（8.26±2.04）%和（12.71±2.53）%，差异有显著性（P＜0.01）。
2.3 哮喘患儿FOXP3 mRNA改变
29例哮喘患儿与24例正常儿童FOXP3/β-actin的2－△Ct值分别为0.49±0.15和0.62±0.18，两者差异也有显著性（P＜0.05）。
2.4 FOXP3 mRNA与CD4+CD25+Treg两者相关性分析
FOXP3 mRNA在外周血单个核细胞中的表达与CD4+CD25+Treg在淋巴细胞中的比例呈一定的正相关（r =0.679，P＜0.05，见图4）。
3 讨论
随着免疫学及分子生物学研究的深入，越来越多的证据表明免疫功能紊乱在儿童支气管哮喘发病机制中起着重要作用，尤其是淋巴细胞亚群的比例和功能紊乱更是当前关注的热点。众所周知，免疫耐受的破坏和Th1/Th3功能失调是哮喘发病的重要环节。目前认为CD4+CD25+Treg是机体免疫系统维持外周耐受的重要调控者，维持其正常的水平和功能将有助于免疫系统对自身抗原的刺激建立良好的耐受状态，从而可抑制哮喘的发生[6]。FOXP3作为一特殊的转录因子特异地高表达于CD4+CD25+Treg上，与其发育和功能成熟密切相关[7-8]。我们通过流式细胞仪和实时荧光定量RT-PCR检测发现，哮喘患儿外周血CD4+CD25+Treg的比例及FOXP3 mRNA的表达低于同年龄的正常对照组，说明哮喘患儿由于CD4+CD25+Treg数量不足，免疫抑制功能下降，导致效应性CD4+T细胞尤其是Th3细胞大量活化，产生大量致炎因子导致哮喘发作或持续；可以设想，这类患者经过治疗或自然缓解后，CD4+CD25+Treg数量和FOXP3 mRNA的表达升高，接近于正常水平，发挥其免疫抑制功能，抑制Th3细胞活化，纠正Th1/Th3失衡，促进哮喘缓解，提示CD4+CD25+Treg参与了哮喘的发生和发展。
SYBR Green I实时定量PCR与普通PCR相比，具有敏感、快速、特异的特点。因无需合成特异探针，使用方便；但同时非特异产物可干扰靶基因的产物定量。SYBR Green I是一种荧光染料，能非特异性地结合到双链DNA中去，一旦结合到双链DNA中后便可以发出荧光，结合状态的荧光强度较游离状态强百余倍，因此可以根据荧光信号强度定量检测双链DNA数量。但是SYBR Green I与双链DNA结合缺乏特异性，在PCR反应中非特异性扩增或者引物二聚体也会产生荧光，可能会发生假阳性。为了避免这种不利因素，本研究在定量反应结束后进行融解曲线分析，以区分由PCR产物和本底造成的荧光信号。分析PCR产物的融解曲线可以证实扩增产物的特异性，特异PCR产物在融解曲线上是单一峰，其Tm值较非目的产物高[9]。我们发现，FOXP3和β-actin的融解曲线均仅有单一峰，Tm值分别为82.4 ℃和87.8 ℃；琼脂糖电泳进一步证实了其扩增特异性。
本文初步结果证实，外周血CD4+CD25+Treg细胞数量和FOXP3 mRNA表达有相同的趋势，存在一定的相关性。我们建立了一种从外周血单个核细胞中检测FOXP3 mRNA的方法，其方法简单，重复性好，并有很高的敏感性和特异性。
参考文献
[1]Fontenot JD，Gavin MA，Rudensky AY.Foxp3 programs thedevelopment and function of CD4+CD25+ regulatory T cells[J].Nat Immunol，2003，4(4):330-336.
[2]Khattri R，Cox T，Yasayko SA，et al An essential role forscurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells[J]. Nat Immunol，2003，4(4):337-342.
[3]Hori S，Nomura T，Sakaguchi S.Control of regulatory T celldevelopment by the transcription factor Foxp3[J].Science，2003，299(5609):1057-1061.
[4]Mochizuki H，Shigeta M，Morikawa A.Develepment of bron-chial hyperresponsiveness during childhood[J].J Asthma，2001，38(1):1-21.
[5]中华医学会儿科学分会呼吸学组.儿童支气管哮喘防治常规(试行)[J].中华儿科杂志，2004，42(2):100-106.
[6]Seroogy CM，Gern JE.The role of T regulatory cells in asthma[J].J Allergy Clin Immunol，2005，116(5):996-999.
[7]Picca CC，Caton AJ.The role of self-peptides in the develop-ment of CD4+CD25+ regulatory T cells[J].Curr OpinImmunol，2005，17(2):131-136.
[8]Yi H，Zhen Y，Jiang L，et al.The phenotypic characterizationof naturally occurring regulatory CD4+CD25+ T cells[J].Cell Mol Immunol，2006，3(3):189-195.
[9]Wittwer CT，Herrmann MG，Moss AA，et al. Continuous fluo-rescence monitoring of rapid cycle DNA amplification[J].Biotechniques，1997，22(1):130-131，134-138