作者：张伟，王洪新，吴国强，刘杰
【摘要】 目的 通过观察κ阿片受体激动对血管紧张素II诱导心肌肥大的作用，研究κ阿片受体激动剂对血管紧张素II诱导心肌肥大的抑制作用。方法 以体外培养的乳大鼠心肌细胞为模型，应用血管紧张素II1 μM诱导心肌肥大，观察U50488H1 μM对它的作用，并和洛沙坦（los）1 μM组做对比观察κ阿片受体的激活对心肌肥大的作用。用Lowry法检测心肌细胞蛋白含量；用消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积；用［3H］-leueine掺入法测定心肌细胞蛋白的合成。结果 AngII1 μM使心肌细胞总蛋白含量，蛋白表达及细胞体积明显增加；U50488H1 μM能够降低由AngII引起的心肌细胞蛋白含量，蛋白表达，以及体积的增加，从而抑制心肌肥大，并且抑制程度与los1 μM相似。结论 κ阿片受体激动剂U50488H能够抑制由AngII诱导的心肌细胞肥大。
【关键词】 心肌肥大 κ阿片受体 U50488H 血管紧张素II
Abstract: Objective To demonstrate the inhibitory effect of κ-Opioid on AngII-induced hypertrophy in cultured myocardial cells of neonatal rats. Methods Based on the model of cardiac bistiocyte cells in vitro culture， the experiment applies the angiotensin II1 μM to induce the myocardium to be hypertrophy. Compared with the group of (los) 1 μM， the experiment observes the effects of the activation of κ-Opioid on myocardial hypertrophy. The protein content was measured by Lowrys method. The protein synthetic rate was obtained through measuring the incorporation of [3H]-leueine into myocyte protein by liquid scintillation method，the cardiomyocytes volumes were measured by computer photograph analysis system; the proteinic compound of the cardiac bistiocytes was measured by the incorporation method of [3H]-leueine. Results AngII (1 μM) can increase the overall protein content， proteinemia expression， and the cells volumes. U50488H1 μM can reduce the protein content of cardiac bistiocyte， protein expression and the cells volumes， which are induced by AngII. Therefore， U50488H1 μM inhibits the myocardial hypertrophy and it has the similar inhibitive extent with the los1 μM. Conclusions κ-Opioid receptor stimulation U50488H can inhibit hypertrophy induced by AngII in neonatal rat ventricular myocytes.
Key words：myocardial hypertrophy; κ-Opioid; U50488H; Angiotersin II
心肌组织上存在κ阿片受体（κ-OR）［1］，近年来关于κ-OR对心肌细胞生长和肥厚的研究较多，本实验室的研究也已经证实κ-OR是心肌细胞的负性调节因子［2］可以抑制去甲肾上腺素诱导的心肌肥大［3］， 并表明选择性κ-OR激动剂U50488H通过激活κ-OR与β1-ＡＲ交互作用抑制Iso诱导的心肌细胞肥大［4］。血管紧张素II（angiotensin II，AngII）是一种多肽类激素，它对肾上腺、肝、肾及血管等多种器官和组织均有作用。而且也已有研究证明心肌组织上也存在着血管紧张素受体1（AT1）［1］438，心肌细胞也是AngII的重要靶器官，很多研究已经证明AngII能够诱导心肌细胞肥大。也已有文献报道，内源性阿片肽与肾素-血管紧张素（RAS）系统有关［5，6］。因此为了进一步探索κ-OR激动剂与AngⅡ诱导心肌肥大的关系，本实验在AngⅡ诱导心肌肥大的基础上，重点观察选择性κ-OR激动剂U50488H及选择性κ-OR阻断剂-nor-BNI（norbinaltorphimine）对AngⅡ诱导心肌肥大的作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物、药品与试剂
出生后2～3 天的SD大鼠，雌雄不拘，由辽宁医学院实验动物中心提供。小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培养基、选择性κ受体激动剂(U50488H)及特异性κ受体拮抗剂（nor-BNI）、 angiotensin Ⅱ、洛沙坦(los)、SDS均购自Sigma公司；考马斯亮蓝购自上海生工。其他试剂均为分析纯。
1.2 乳大鼠心肌细胞原代培养
在无菌条件下，取生后1～3 d的SD大鼠心脏，放入D-Hanks液冲洗3 次后，剪成约1 mm×3 mm的小碎块，用0.8 g·L-1胰蛋白酶消化分离细胞，向分离的细胞中加入15％的小牛血清，84％的DMEM培养基， 1％的双抗液(含1×10 U·L-1青霉素，100 μg链霉素)的培养基，及0.1 mmol/L 5-溴脱氧尿苷（主要抑制成纤维细胞的生长），吹打均匀后以5×109·L-1 的密度接种于24孔培养板，送入通以0.05 CO2及0.95空气的二氧化碳孵箱中培养。
1.3 分组及给药方法
常规培养心肌细胞2 天后，为了减少血清中的成分对实验结果的影响，更换含0.4％小牛血清的培养基及各种浓度的试剂。设为对照组，其他组分别加入AngII 1 μM；AngII 1 μM +los 1 μM；AngII 1 μM+U50488H 1 μM；AngII 1 μM+U50488H 1 μM+nor-BNI 1 μM。给药48 h后进行各指标的测定。
1.4 培养心肌细胞蛋白质含量的测定
吸去培养板各孔中的培养基，用D-Hanks液快速冲洗3 次后，加入10g·L-1SDS 0.5 mL溶解细胞，根据计数，每孔细胞数约为5×105个，Lowry等［7］方法测定每孔细胞蛋白质含量。
1.5 培养心肌细胞体积的测定
细胞体积是通过测量细胞直径获得的，用D-Hanks液快速冲洗长满细胞的培养孔3 次，每孔加0.3 mL/（g·L）胰蛋白酶，放入37 ℃恒温箱中30 min后，再加入0.2 mL含有体积分数为0.1血清的培养基终止消化，收集细胞注入一细胞室内（该细胞室底部是一经硅化的盖玻片，以防心肌细胞贴壁），在放大400倍的倒置显微镜下观察其中的细胞，几乎均呈球形。用计算机CIAS大恒细胞图象分析系统测量单个细胞的直径，进而计算出细胞的体积。每孔随机选择4个视野，每个视野测20 个细胞。
1.6 培养心肌细胞蛋白质合成的测定
培养48 h后更换含有37TBq·L-1 ［3H］- 亮氨酸及各种浓度试剂的培养基，一起培养72 h后倒掉培养液，用冷D-Hanks液快速洗3遍，每孔加入1 mL 10 g·L-1 SDS溶解细胞，应用49型玻璃纤维滤膜过滤，之后用2 mL三氯醋酸（0.2 kg·L-1）沉淀蛋白，2 mL体积分数0.95～0.99乙醇抽滤，烘干滤膜，用液闪仪（Paclard，Tricard2200 CA，美国）测量［3H］- 亮氨酸的结合，进行蛋白质合成的分析。根据计数，每孔的细胞数大致为5×104个，实验结果以每孔的cpm值计算。
1.7 统计学处理
所有数据均以均数±标准差(±s) 表示，采用单因素方差分析及LSD法进行统计学处理。
2 结果
2.1 不同处理因素对心肌细胞蛋白含量的影响
表1的数据显示，与对照组相比，AngII组心肌细胞蛋白含量增加了54%；与AngII组相比，AngII+los、AngII+U50488H组的心肌细胞蛋白含量均降低，分别降低了37%、35%，表明U50488H和洛沙坦均能抑制AngII诱导的心肌细胞蛋白含量的增加，且U50488H的抑制作用与los的作用相似；AngII+U50488H+nor-BNI组的蛋白含量与AngII组相比未见明显变化，表明nor-BNI可以完全抑制U50488H的作用。
表1 不同处理因素对心肌细胞蛋白含量的影响（略）
不同处理因素作用于心肌细胞48 h，﹡P&< 0.01，与正常组比较；#P&< 0.05， 与AngII组比较；△P&< 0.01 与AngII组比较
2.2 不同处理因素对心肌细胞体积的影响
表2的结果显示，与对照组相比，AngII组心肌细胞体积增大了84%；与AngII组相比，AngII+los、AngII+U50488H组的心肌细胞体积均减小，分别减小了51%、48%，表明U50488H和洛沙坦均能抑制AngII诱导的心肌细胞体积的增大，且U50488H的抑制作用与 los的作用相似；AngII+U50488H+nor-BNI组的细胞体积与AngII组相比未见明显变化，表明nor-BNI可以完全抑制U50488H的作用。
表2 不同处理因素对心肌细胞体积的影响（略）
﹡P&< 0.01， 与正常组比较；#P&< 0.01， 与AngII组比较;△P&< 0.01，与AngII组比较
2.3 不同处理因素对心肌细胞蛋白合成的影响
表3显示，与对照组相比，AngII组心肌细胞蛋白合成增加了32% ；与AngII组相比，AngII+los、AngII+U50488H组的心肌细胞蛋白合成均降低，分别降低了24%、 22% 表明U50488H和洛沙坦均能抑制AngII诱导的心肌细胞蛋白合成的增加，且U50488H的抑制作用与los的作用相似；AngII+U50488H+nor-BNI组的蛋白合成与AngII组相比未见明显变化，表明nor-BNI可以完全抑制U50488H的作用。
表3 不同处理因素对心肌细胞蛋白合成的影响（略）
﹡P&< 0.01， 与正常组比较； #P&< 0.01 ，与AngII组比较；△P&< 0.01 与AngII组比较
3 讨论
心肌肥大是指心肌细胞增大而无细胞分裂，是对血液动力超负荷和／或神经体液刺激的适应性反应。疾病的初始阶段，心肌肥厚可以通过平衡应激的增加改善心脏的功能，然而，长时间应激所致的持续性心肌肥厚最终会因心脏功能失常导致心力衰竭。目前，心肌肥厚已被公认为是猝死，心力衰竭等心血管事件强有力的独立危险因素［7］，因此，探明其发生发展机制一直是心血管领域的重要课题［8］。
许多研究表明，血管紧张素II作为诱导心肌肥厚的神经体液刺激因素之一，其绝大部分心血管效应则由属于7次膜贯通型G蛋白偶联受体家族中的AngII受体1型（AT1）介导完成［9］。已有研究表明，在体外培养的心肌细胞中加入AngII后，可诱导心肌细胞体积增大，RNA转录和蛋白质合成增加，呈剂量和时间依赖性［10］。因此本研究采用了AngII 1 μM的浓度，能够明显的诱导心肌细胞肥大。本实验的结果显示，AngII刺激心肌细胞时，蛋白合成、蛋白含量以及细胞体积均明显增加。这些作用当用洛沙坦拮抗时可完全被抑制，证明了AngII刺激心肌细胞是通过AT1介导的。本实验还发现，κ-OR激动剂U50488H作用于AngII诱导的心肌肥大时能够明显降低蛋白质表达、含量及细胞体积的增加，并且这种作用可被选择性κ-OR阻滞剂nor-BNI所阻断。表明U50488H能够抑制AngII诱导的心肌肥大，并且还发现其作用和los抑制AngII诱导的心肌肥大作用相似，提示κ-OR与AT1之间有交互作用，这种交互作用可能是通过G蛋白偶联受体家族实现的。已有研究表明，刺激κ阿片受体（κ-OR）可通过多种途径使［Ca2+］i瞬变的幅度下降［11-13］。同时，激动心脏阿片受体后， 可激活百日咳毒素-敏感性G蛋白-磷脂酶C-三磷酸肌醇-Ca2+途径， 使SR 中的Ca2+耗竭。在心肌细胞，U50488H也可产生激活K+外流的作用［14］， 而使动作电位的时间缩短。复极化加快将会使通过L-型Ca2+通道内流的Ca2+减少， 并导致SR 对Ca2+回摄的降低， 使［Ca2+］i瞬变的幅度进一步下降。以上这些机制都造成了细胞内钙释放及［Ca2+］i浓度的下降， 从而抑制了心肌肥厚的发生和发展。然而AngII刺激心肌细胞肥大时也刺激Ca2+的释放，对Ca2+的内流也有影响，因此U50488H对AngII诱导心肌细胞肥大的抑制作用也可能是通过调节细胞内Ca2+稳态来实现的。
本实验研究结果虽然表明了阿片受体激动对AngII诱导的心肌肥大有抑制作用，但是阿片肽直接调节AngII的程度是很难说清楚的。因为交感神经在血流动力学障碍时引起的作用是很复杂的；血流动力学障碍时，阿片肽对AngII的作用也是很复杂的［15］，所以U50488H具体通过何种信号转导途径发挥它对AngII的抑制作用还不甚清楚。有待进一步的探索。
参考文献
［1］ Rogers TB，Gan ST，Allen Is.Identification and characterisation of functional angiotensin I receptors on cultured heart myocytes ［J］ .Pharmacol EIp Ther，1986，236: 438.
［2］ Guijun Wang，Hongxin Wang，Yanling Yang，et al.κ-Opioid receptor stimulation inhibits growth of neonatal rat ventricular myocytes ［J］.European Journal of pharmacology， 2004，498:53-58.
［3］ Yang YL， Wang HX， Yang L， et al. Inhibitory effects ofκ-opioid receptor stimulation on NE-induced cardiac hypertrophy of the cultured myocardial cells［J］.Chin Pharmacol Bull（中国药理学通报）， 2002，18(1)：91-94.
［4］ Shan D，Wang H，Su Y，et al.Kappaopioid by β1-adrenoceptor stimulation in the rat ［J］.Eur J Pharmacol，2007，555(2-3):100-105.
［5］ Fukuhara M，Matsumura K，Abe I，et al.Interaction of opioids and vasopressin in central action of angiotensin II in conscious rabbits［J］.Hypertens Res， 1998，21:89-95.
［6］ Takai S，Song K，Tanaha T，Okunishi H，Miyazaki M.Antinociceptive effects of angiotensin-converting enzyme inhibitors and an angiotensin II receptor antagonist in mice［J］.Life Sci， 1996，59:PL331-PL336.
［7］ Messerli FI-I，Aristizabal D，Sofia F.Reduction of left ventriCU—lar hypertrophy：How beneficial［J］.Am Heart J，1993，125：1520-1524.
［8］ Levy D，Garrison RJ，Savage DD.Prognostic implications of echocardiographically determined left ventricular mass in tlle framingham heart studyE［J］.N En J Med，1990，323：1706-1707.
［9］ Matsubara H. Pathophysiological role of angiotensin Ⅱ type 2 receptor in cardiovascular and renal diseases［J］. Circ Res ，1998 ，83(12) :1182.
［10］ Baker KM，Aceto JF.Angiotensin II stimulation of protein synthesis and cell growth in chick heart cells［J］.Am J Physiol， 1990，259(2 Pt 2)：H610-618.
［11］ Yu XC，Wang HX，Zhang WM，et al.Cross-talk between cardiacκ-opioid and β-adrenergic receptors in developing hypertensive rats［J］. J Mol Cell Cardiol，1999，31:597-605.
［12］ 陈迈，裴建明，李兰荪，等.U50488H对大鼠腹主动脉的舒张作用及机制［J］.第四军医大学学报，2000，22(1):29-32.
［13］ Pei JM，Zhou JJ，Bian JS，et al.Impaired［Ca2+］I and pHi responses to κ-opioid receptor stimulation in the heart of chronically hypoxic rats［J］.Am J Physiol (Cell Physiol)，2000，279:C1483-C1494.
［14］ Ventura C，Spurgeon H，Lakatta EG，et al. κ andδopioid receptor stimulation affects cardiac myocyte function and Ca2+ release from an intracellular pool in myocytes and neurons［J］.Circ Res，1992，70:66-81.
［15］ Xiang JZ， Linz W， Becker H， et al. Effects of converting enzyme inhibitors:ramipril and enalapril on peptide action and sympathetic neurotransmission in the isolated heart［J］.Eur J Pbarmacol， 1985，113:215-523.