作者：周艳，张美玲，田自有，何宏章，金利泰，李校
【摘要】 目的 ：建立温莪术的双向电泳技术(2-DE)体系。方法：采用TCA/丙酮沉降法提取蛋白，并用超速离心去除杂质。采用固相pH胶条在IPGphor TM III等电聚焦系统上进行等电聚焦，采用Bio-Rad电泳仪进行SDS-PAGE电泳，以银染法染色。结果：得到了上百个点的双向电泳图谱。结论：本研究成功建立了温莪术蛋白双向电泳技术体系。
【关键词】 蛋白提取;双向电泳;TCA/丙酮沉降法;超速离心
Abstract: Objective: To establish the system of 2-D gel electrophoresis proteome of the leaf of Curcuma wenyujin. Methods: The total proteins of root were extracted with trichloroacetic acid (TCA)/acetone precipitation method and ultracentrifugation，and then separated by two-dimensional electrophoresis (2-DE)， which was an IPGphor TM unit with immobile pH gradient strips used in and the Ettan TM DaltⅡsystem in SDS-PAGE. The 2-D gel was stained with silver. Results: Near hundred 2-D electrophorogram was gained by this method. Conclusion:
A system of two-dimensional electrophoresis of curcuma wenyujin is successfully established.
Key words: protein extraction;two-dimensional electrophoresis(2-DE);trichloroacetic acid(TCA)/acetone precipitation method;ultracentrifugation
O’Farrell于1995年创立的聚丙烯酰胺双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis， 2-DE)是目前分析组分复杂蛋白质分辨率最高的工具之一。近年来，双向电泳技术在植物中应用日多，但主要集中在拟南芥、水稻、小麦等典型植物上，而在药材中的应用报道较少[1-3]。温州的地道药材——温郁金(Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling)是一种多年生草本姜科植物，其地下茎习称温莪术，块根习称温郁金，是浙八味之一。中医认为莪术有破瘀、行气、消积和止痛的功效。近年来，研究还发现它有抗癌、抗肿瘤、抗凝血、抗氧化和保肝等活性[4]。目前有关莪术的报道大多是关于药材总提取物的药理活性及其在临床上的应用，对莪术的蛋白质组学却鲜见报道，本研究成功建立了温莪术蛋白双向电泳技术体系，对温莪术植株本身进行蛋白质组学初步研究，填补了空缺。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料：温莪术取自瑞安温莪术GLP基地(批次：20071215)，洗净泥沙后切片分装，-80 ℃保存。
1.1.2 试剂：所有试剂均为分析纯，IPG预制胶条、IPG buffer购自GE公司(原Amasham公司);丙烯酰胺、甲基双丙烯酰胺、甘氨酸、SDS、尿素、硫尿、低分子量标准蛋白均购自Sigma公司;DTT、碘乙酰胺进口分装，其他为国产试剂。样品提取液(25 mmol/L Tris HCl，10 mmol/L KCl，20 mmol/L MgCl2，1 mmol/L PMSF，2 mmol/L EDTA，10 mmol/L DTT);蛋白裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫尿，2% CHAPS，40 mmol/L Tris-base);水化液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫尿，2% CHAPS);平衡缓冲液(储存液)[50 mol/L Tris HCl (pH 8.8)，6 mol/L 尿素，30%甘油，2% SDS，0.25%溴酚蓝溶液];平衡液I(1% DTT的储存液);平衡液II(2.5%碘乙酰胺的储存液);染色液：经典银染法中的各种溶液(固定液，增敏液，银染液，显影液，终止液);琼脂糖封胶液(0.5%琼脂糖/0.002%溴酚兰的电极液)。
1.1.3 主要仪器：IPGphor TM III等电聚焦仪器(美国GE公司);冷冻台式高速离心机(德国eppendorf公司);SDS-PAGE垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司);超速离心机(美国贝克曼库尔特有限公司，型号：ProteomeLab XL-A/XL-I);Tytoon 9100扫描仪(美国GE公司)。
1.2 方法
1.2.1 蛋白提取：取新鲜莪术，在液氮中研磨成粉末，称取莪术粉末0.4 g，加入3 mL 提取液，DTT在PMSF加入5 min后加入，混匀，超声破碎5 min; 4 ℃放置2 h，每半小时混匀一次。离心(12 000 r/min，15 min，4 ℃)，取上清再离心一次。取上清，加10倍体积的TCA/丙酮溶液沉淀过夜，离心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)，用2 mL乙醇洗两次，再用2 mL丙酮/0.07% DTT溶液洗2次，离心后，沉淀自然干燥，加裂解液200μL，室温放置5 h，离心取上清备用。
1.2.2 蛋白浓度测定：采用Bradford法，取10只0.5 mL的EP管，依次编号1至10，编号10加入的蛋白为样品溶液，按照表1依次加入各试剂并且测量595 nm下的吸光度值制作标准曲线，并画出BSA标准曲线图并计算出待测样品蛋白浓度为：1.053 mg/mL。
1.2.3 等电聚焦：取出一根7 cm的IPG胶条室温解冻。然后取50μL样品溶液加入60μL水化液，再加入20μL 1 mol/L的DTT储液、1μL IPG buffer(pH 4～7)和1μL 0.5%的溴酚兰溶液。混匀后，12 000 r/min离心10 min，取125μL上清加入胶条槽中，去掉胶条的保护模，胶面朝下，将IPG胶条尖端(+端)朝标准型胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，使水化液浸湿整个胶条。最后加入适量的覆盖油。按表2所列参数进行IPG胶条的泡涨和等电聚焦电泳，并且最大电流为50 mA/根胶条;温度为20 ℃。
1.2.4 胶条的平衡及SDS-PAGE：等电聚焦结束后用去离子水冲洗掉胶条表面的矿物油，进行第一次平衡：将IPG胶条放置在事先盛有5 mL平衡液I的平衡管中平衡15 min， 再用去离子水冲洗掉胶条表面，用镊子夹住胶条的一端，使胶条的侧边接触滤纸，吸干多余的液体，然后进行第二次平衡：在平衡液II中平衡15 min，最后用去离子水冲洗胶条数秒，并用滤纸吸掉多余的液体。剪取约0.4 mm2的滤纸片，上加5μL标准蛋白，并用热的琼脂糖封盖。与平衡好的IPG胶条一同放置于SDS胶面上，带有标准蛋白的滤纸置于胶条的碱性端。胶条上面覆盖热的琼脂糖溶液，操作时要防止胶条与SDS-PAGE胶接触面产生气泡。SDS-PAGE规格是：105 mm×75 mm， 胶厚度为1 mm，胶浓度为12%。第二向SDS-PAGE，首先以15 mA恒流电泳15 min，使蛋白进入分离胶中;随后以20 mA电泳约1.5 h，待溴酚蓝迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。
1.2.5 染色：采用经典的银染法[5]。
2 结果
实验结果如图2所示：从左至右pH 4～7，SDS-PAGE胶的最右边为蛋白Marker。可见上百个蛋白点并且分布较均匀，左下角的大斑点很可能是莪术的一个高丰度蛋白。
3 讨论
蛋白质组学是当今研究的一大热门。双向电泳技术是蛋白质组学的关键技术之一。影响双向电泳技术体系建立的因素很多：材料的选择，提取方案的选择，实验技术的熟练程度，试剂的纯度，检测方法的灵敏度等。现将就以下几个方面展开讨论。
3.1 植物材料的选择 相对动物组织来说，植物组织的蛋白提取制备方法要复杂得多。植物材料蛋白质含量低，加之植物组织中色素、酚、醌及其他多种次生代谢产物的干扰，植物药材常见的活性物质如生物碱、胺类、萜类、黄酮类、醌类、皂苷、强心苷等绝大多数属于次生代谢产物。如果样品处理不当，这些物质将会严重干扰等电聚焦结果，使得传统的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳难以取得满意的效果，因此，所研究的植物组织本身在很大程度上影响了最终的图谱效果。本论文研究对象莪术属于植物的块根，质地坚硬，是植物组织器官中最难处理的部分，在多次摸索实验方案后才获得较理想的2-DE图谱。
3.2 提取和纯化方法的选择 由于不同生物大分子结构及理化性质不同，分离方法也不一样，即使是同一类生物大分子，由于选用材料不同，使用方法差别也很大，因此很难有一个统一标准的方法对任何蛋白质均可循用。本研究选取的TCA/丙酮沉淀法是常用的植物根部蛋白提取方法。其中TCA的作用有[6]：①在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐;②作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变，暴露出较多的疏水性基团，使之聚集沉淀;③随着蛋白质分子量的增大，其结构复杂性与致密性越大，TCA可能渗入分子内部而使之较难被完全除去，在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片，而且随时间的延长这一作用愈加明显;④TCA与蛋白质结合后使SDS与蛋白质的结合量产生偏差，从而造成蛋白质所带电荷的不均一性，造成迁移率的不一致。本研究在制备温莪术全蛋白质过程中采用10% TCA/冷丙酮沉淀蛋白质，目的是为了有效地抑制了蛋白酶对蛋白质的水解作用，以及除去色素、酚等干扰电泳效果的物质。另外，盐离子、多糖是严重干扰双点电泳的物质，过高盐离子浓度可能会导致IEF停止，而多糖类(尤其是带电荷的多糖)会导致2-DE图中出现横。本研究在提取蛋白的过程中，增加了丙酮清洗的次数，能够更彻底地去除上述杂质。
3.3 对提取物的保护 温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。在各种细胞中普遍存在着蛋白水解酶，提取时为了防止由它引起的水解，本研究中降低提取温度其目的也是防止蛋白水解酶的水解。另外在提取液中加金属螯合剂如EDTA 的目的是为了保护维持蛋白活性所需的巯基。
综上所述，本实验在考虑上述多种因素的前提下，采用改良过的TCA/丙酮沉降法和超速离心的方方法提取温莪术蛋白进行双向电泳，跑出了比较理想的图谱，初步建立了中药温莪术的双向电泳技术体系，这为莪术的蛋白质组学研究迈出了关键性的一步，并且能为姜科植物的双向电泳技术体系建立提供借鉴。
参考文献
[1]Timothy Palzkill，Kluwer.Proteomics[M].New York:KluwerAcademic Publishers，2002:2.
[2]Lilley KS， Razzaq A， Dupree P. Two-dimensional gelelectrophoresis: recent advances in sample preparation， de-tection and quantitation [J]. Curr Opin Chem Biol， 2002， 6(1):46-50.
[3]Carpentier SC， Witters E， Laukens K. Preparation of pro-tein extracts from recalcitrant plant tissues: an evaluationof different methods for two-dimensional gel electrophore-sis analysis[J]. Proteomics， 2005， 5(10): 2497-2507.
[4]朱善岚， 黄品芳， 王友芳. 莪术的药理作用研究进展[J]. 海峡医学，2007， 19(4): 9-11.
[5]郭尧君. 蛋白质电泳实验技术[M].北京：科学出版社出版，2005:107.
[6]郭立安，阎哲，张晓楠，等. 三氯乙酸对蛋白质结构稳定性的影响[J].第四军医大学学报，2001，22(22):封3-01.