作者：郎玮，王海波，吴建波，章圣辉，蔡慎初，尹丽慧
【摘要】 目的 ：探讨蔡氏扶正消汤对人体外生长胃癌细胞SGC-7901表面黏附分子的影响以及作用的计量和效应关系。方法：流式细胞仪检测细胞膜表面E-Cadherin，CD44，CD44-v6和CD54的表达。结果：蔡氏扶正消汤作用48 h后，SGC-7901细胞膜表面的E-Cadherin表达增高，CD44、CD44-V6和CD54表达减少。随着药物剂量增加，E-Cadherin表达阳性细胞表达逐渐升高;CD44、CD44-v6、CD54表达的阳性细胞比率逐渐下降，抑制率也逐渐升高。结论 ：蔡氏扶正消汤在抑制人胃癌细胞SGC-7901体外增殖的基础上，能够增加胃癌细胞SGC-7901表面E-Cadherin的表达，减少胃癌细胞SGC-7901表面CD44，CD44-V6和CD54的表达，并在计量和效应间存在联系，说明蔡氏扶正消汤能阻止胃癌SGC-7901细胞对邻近正常组织的浸润及远处转移，从而发挥抗癌作用。
【关键词】 中药方剂;胃癌细胞;E-钙黏蛋白;CD44;CD54
Abstract: Objective: To investigate the effects as well as dose and effects relationship of Prescription of Cai-shi-fu-zheng-xiao-zheng-Tang on the proliferation and cell adhesion molecule changes of human gastric carcinoma cell line SGC-7901 in vitro. Methods: Flow cytometry was used to analyze the expression of cell adhesion molecules， including E-Cadherin， CD44， CD44-V6 and CD54. Results: Cai-shi-fu-zheng-xiao-zheng-Tang inhibited the proliferation of SGC-7901 cells in a dose-and time-dependent manner. with the expression of E-cadherin increased concomitant with CD44， CD44-V6 and CD54 depressed. Conclusion: Cai-shi-fu-zheng-xiao-zheng-Tang plays its anti-cancer func-tion through inhibit proliferation and effect on cell adhesion molecules.
Key words: prescription of traditional Chinese medicine;human gastric carcinoma cell;E-Cadherin;CD44;CD54
恶性肿瘤的一个重要生物学特征是其对邻近正常组织的浸润及远处转移。目前已知肿瘤的浸润以及转移与其黏附分子表达的改变有关。蔡氏扶正消癥汤(Cai-shi-fu-zheng-xiao-zheng-Tang)是我院国家级名老中医蔡慎初教授从事中医临床四十年的经验总结，对胃癌具有良好的疗效，能够提高患者的生活质量，延长患者的生存期。在我们前期的研究中，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法检测了扶正消癥方药液对SGC-7901细胞增殖的影响，结果提示扶正消癥汤明显抑制SGC-7901细胞的增殖，并存在明显的时间-效应和剂量-效应关系;应用电镜和流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果显示蔡氏扶正消癥汤能使SGC-7901细胞的细胞周期阻滞并进一步导致细胞凋亡[1]。为进一步探讨其抑制胃癌SGC-7901细胞对邻近正常组织的浸润及远处转移作用的机制，我们通过体外实验，观察药物对胃癌细胞膜表面黏附分子的影响，为其用于胃癌的临床治疗提供实验基础。
1 材料和方法
1.1 细胞株和细胞培养 胃癌细胞SGC-7901购自中国科学院上海生化和细胞生物研究所。将SGC-7901细胞接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每2～3天换液一次，长满后常规胰蛋白酶消化法传代培养。
1.2 蔡氏扶正消汤水煎剂的制备 蔡氏扶正消癥汤根据中医“扶正”、“固本”和“去邪”原则组方，由黄芪、人参、温莪术、藤梨根、露蜂房、苏铁叶、八月扎、白毛藤、徐长卿等药物组成。经三蒸水漂洗3次，于烧杯中煎煮30 min去渣，8层纱布过滤，浓缩，含生药1.0 g/mL，调pH值至7.0～7.2，4 ℃保存备用。
1.3 主要试剂和仪器设备 RPMI1640购自美国GIBCO公司;胎牛血清购自正江高科技有限公司;胰蛋白酶购于Sigma公司;Mouse IgG1 FITC、 Mouse IgG1 PE、CD54 FITC、E-Cadherin PE、CD44-V6 FITC以及CD44 PE均购自R&&D Systems公司。流式细胞仪FACSCalibur，系Becton Dickinson公司产品。
1.4 实验方法 在6孔培养板中每孔接种6×105个SGC-7901细胞，24 h后分别加入0、5、10、20、30、40 g/L蔡氏扶正消癥汤生药，继续培养48 h，收集细胞，PBS洗2次，加胰蛋白酶250μL室温孵育10 min，再加少许血清中和，PBS洗2次，细胞分成三管，每管各加Mouse IgG1 FITC/Mouse IgG1 PE，CD44-V6 FITC/CD44 PE、CD54 FITC/E-Cadherin PE各 5μL，室温避光孵育20 min，PBS洗2次，离心后沉淀加200μL重悬上机检测，获取和分析均经CELLQuest 3.2软件处理。
1.5 统计学处理方法 不同药物浓度组间的比较采用完全随机设计的方差分析，各药物浓度组与对照组的比较采用Dunnett t检验。
2 结果
蔡氏扶正消癥汤使SGC-7901细胞表面E-Cadherin的表达升高，使CD44、CD44-V6、CD54的表达降低，见表1。
扶正消癥方药液作用SGC-7901细胞48 h，SGC-7901细胞膜表面的E-Cadherin表达增高，CD44、CD44V6和CD54表达减少，20 g/L组差异有统计学意义(P&<0.05)，30 g/L组和40 g/L组差异亦有显著性(P &<0.01)。同一时段(48 h)，随着药物剂量增加，E-Cadherin表达阳性细胞比率逐渐升高;CD44、CD44-V6、CD54表达的阳性细胞比率逐渐下降，抑制作用逐渐增强，抑制率也随之升高。提示蔡氏扶正消癥汤升高SGC-7901细胞E-Cadherin的表达，降低CD44，CD44-V6，CD54的表达呈现明显的剂量和依赖关系，见图1。
3 讨论
胃癌是临床常见的恶性肿瘤，可归属于中医胃脘痛、伏梁、积聚、噎嗝等范畴。胃癌表现为脾胃气虚或气血俱虚，免疫功能低。蔡氏扶正消癥汤中的人参、温莪术、藤梨根、露蜂房等具有良好抗肿瘤作用。其中人参皂甙Rg3和人参皂甙Rh3具有抑制肿瘤细胞的黏附、浸润、增殖以及抗肿瘤新生血管的形成作用，并能诱导肿瘤细胞凋亡、分化，从而有显著的抗肿瘤作用[2]。
黏附分子是介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合的一类分子，大都为糖蛋白，分布于细胞表面或细胞外基质中。黏附分子以配体受体相对应的形式发挥作用，参与细胞的信号传导与活化、细胞的生长及分化、肿瘤转移等一系列重要生理和病理过程。肿瘤细胞某些黏附分子表达的减少可以使细胞间的附着力减弱，肿瘤细胞脱离与周围细胞的附着，同时，肿瘤细胞表达的某些黏附分子使已入血的肿瘤细胞得以黏附血管内皮细胞，造成血行转移。
E-cadherin是一种钙依赖性的具有使细胞之间产生黏附功能的糖蛋白，是产生细胞连接的分子基础。有研究表明许多肿瘤如乳腺癌、结肠癌、胃癌、膀胱癌均可出现E-cadherin的减少，E-cadherin的减少使肿瘤细胞之间的黏附力降低，肿瘤细胞容易脱落而出现转移。因此E-cadherin被看作是抑制肿瘤转移的因素[3，4]。Caldeira[5]的研究表明，对于较小的乳腺肿瘤，E-cadherin的表达与淋巴转移具有相关性，认为E-cadherin的减低是肿瘤转移过程中的早期事件。本实验研究发现蔡氏扶正消癥汤可使SGC-7901细胞表面E-Cadherin表达升高28.77%，使肿瘤细胞丧失其浸润能力。
CD44是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，主要参与细胞与基质间的黏附，且参与细胞的伪足形成，与细胞的迁移有关[6]。不同的CD44分子在肿瘤浸润与转移过程中的作用可能是不同的，正常组织细胞或非转移的癌细胞主要表达CD44s，而具有转移能力的癌细胞主要表达CD44V，尤其CD44-v6通过与细胞外基质中的透明质酸、层黏连蛋白和细胞骨架等蛋白结合，介导肿瘤细胞迁移，促进恶性肿瘤细胞的转移。且CD44-v6阳性患者的预后大多较差，但与临床预后无显著相关性，经多因素分析认为高CD44s表达是独立于肿瘤分期、淋巴结状态的预后指标[7-8]。本研究表明，蔡氏扶正消癥汤处理后的SGC-7901细胞CD44、CD44-V6表达明显减少， 40 g/L药物作用48 h后，CD44和CD44-V6阳性细胞数分别降低了58.40%和2.11%，表明蔡氏扶正消癥汤可明显抑制肿瘤细胞与内皮细胞的黏附，减轻肿瘤的转移。
CD54为相对分子质量70～110 kDa的糖蛋白，介导细胞与细胞间的相互作用，其天然配体为白细胞功能相关抗原1(LFA-1)[9]。恶性肿瘤中ICAM-1的高表达与肿瘤转移有关[10]。本研究表明，蔡氏扶正消癥汤处理后的SGC-7901细胞CD54表达明显减少，40 g/L药物作用48 h后，CD54阳性细胞数降低了67.12%，表明蔡氏扶正消癥汤明显抑制SGC-7901细胞的侵袭、运动能力及其与内皮细胞之间的黏附性和黏附分子的表达，降低血行转移的能力。
总之，蔡氏扶正消癥汤的抗黏附作用可能与其抗肿瘤转移有关，确切的机制有待于进一步研究。
参考文献
[1]郎玮，叶人，谢泳泳，等.扶正消癥方药液诱导胃癌细胞凋亡的实验研究[J].中国中医药科技，2006，13(5):296-298.
[2]Yun TK， Lee YS， Lee YH，et al. Anticarcinogenic effect ofPanax ginseng C.A. Meyer and identification of activecompounds[J]. J Korean Med Sci，2001，12(16):S6-18.
[3]Mittari E， Charalabopoulos A， Batistatou A， et al. The roleof E-cadherin/catenin complex in laryngeal cancer[J]. ExpOncol，2005， 27(4):257-261.
[4]Cowin P， Rowlands TM， Hatsell SJ. Cadherins and cateninsin breast cancer[J]. Curr Opin Cell Biol， 2005，17(5):499-508.
[5]Caldeira JR， Prando EC， Quevedo FC， et al. CDH1 promoterhypermethylation and E-cadherin protein expression in in-filtrating breast cancer[J]. BMC Cancer，2006，6(1):48.
[6]Li M， Amizuka N， Takeuchi K， et al. Histochemical evi-dence of osteoclastic degradation of extracellular matrix inosteolytic metastasis originating from human lung small car-cinoma (SBC-5) cells[J]. Microsc Res Tech，2006 ，69(2):73-83.
[7]Montgomery E， Abraham SC， Fisher C， et al.CD44 loss ingastric stromal tumors as a prognostic marker[J]. Am J SurgPathol，2004，28(2):168-177.
[8]Diaz LK， Zhou X， Wright ET，et al. CD44 expression isassociated with increased survival in node-negative invasivebreast carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2005，11(9):3309-3314.
[9]Obiri NI， Tandon N， Puri RK. Up-regulation of intercellularadhesion molecule 1 (ICAM-1) on human renal cell carci-noma cells by interleukin-4[J]. Int J Cancer， 1995，61(5):635.
[10]Rosette C， Roth RB， Oeth P，et al. Role of ICAM1 in inva-sion of human breast cancer cells[J]. Carcinogenesis，2005，26(5):943-950.