作者：陈培荣，朱载华，邹正平，朱小春
【摘要】 目的 ：观察三氧化二砷(ATO)对MRL/lpr狼疮小鼠脾脏CD4+T细胞分泌IFN-γ及其mRNA的影响。方法: 免疫磁珠分别分选18～20周MRL/lpr狼疮小鼠和C57BL/6J正常对照小鼠脾脏CD4+T细胞，采用流式细胞术鉴定细胞纯度。PHA-p(20μg/mL)和IL-2(1 000 IU/mL)常规刺激48 h后进行如下实验:(1)不同浓度ATO(0.5、1.0和2.0μmol/L)作用24 h;(2)1μmol/LATO作用不同时间(12、24和48 h);(3)不同药物处理组:①PBS组:空白对照;②ATO组:1μmol/LATO;③5-氮杂胞苷(5-AzaC)组:1μmol/L 5-AzaC;④ATO+5-AzaC组：1μmol/LATO+1μmol/L 5-AzaC。酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养上清液IFN-γ的表达量;实时荧光定量PCR法检测不同药物处理组中IFN-γmRNA的表达情况。结果:①1.0μmol/LATO作用24 h对细胞存活率无明显影响。②1 mmol/lATO作用24 h能抑制MRL/lpr小鼠脾脏CD4+T细胞IFN-γ的转录和翻译水平。③经5-AazC处理后MRL/lpr和C57BL/6J小鼠脾脏CD4+T细胞IFN-γ的转录和翻译水平升高，1 mmol/LATO作用24 h能抑制其异常活化状态。④MRL/lpr小鼠脾脏CD4+T细胞IFN-γ的分泌和表达水平均较C57BL/6J小鼠明显升高。结论: 1 mmol/L ATO作用24 h能在一定程度上有效抑制活化状态下MRL/lpr小鼠脾脏CD4+T细胞IFN-g的异常分泌，下调其mRNA表达水平而不影响其存活率。
【关键词】 系统性红斑狼疮;三氧化二砷;5-氮杂胞苷;γ-干扰素
Abstract: Objective: To investigate the effects of arsenic trioxide (ATO) on the levels of IFN-γexpression and its mRNA transcripts in splenic CD4+T cells from MRL/lpr mice. Methods: CD4+T cells were isolated from the spleens of MRL/lpr and C57BL/6J mice as control via magnetic bead separation at 18 to 20 weeks of age. Cell purity was checked by flow cytometry. CD4+ T cells were stimulated for 48 h in the presence of PHA-p(20μg/ml)and IL-2(1 000 IU/ml). Then cells were treated with ATO(0.5，1.0 and 2.0μmol/L) for 24 h，which were also exposed to 1.0μmol/L ATO treatment for 12，24 and 48 h. In addition，cells were added with ATO，or 5-azacytidine (5-AzaC) or ATO combined with 5-AzaC at 1.0μmol/L，respectively，as compared to those given PBS. Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)was used to measure serum levels of IFN-γ. A real-time fluorescent quantitative PCR (FQ-PCR) was set up to determine IFN-γ mRNA expression in different drugs-treated-CD4+T cells. Results: ①ATO(1.0 μmol/L) was of no effect on survival rate of cells cultured for 24 h.②After treated with 1.0μmol/L ATO for 24 h，transcription and interpretation levels of IFN-γin splenic CD4+T cells from MRL/lpr mice were inhibited. ③In the presence of 5-AazC，the levels mentioned above markedly increased in MRL/lpr and C57BL/6J mice，which could be also inhibited by 1.0μmol/L ATO after a 24-h incubation.④The production and mRNA expression of IFN-γ of splenic CD4+T cells were significantly higher in MRL/lpr mice，compared to C57BL/6J mice. Conclusion: The treatment of splenic CD4+T cells with 1.0 μmol/L ATO by culturing for 24 h could efficiently inhibit abnormal secretion level of IFN-γ in MRL/lpr mice，and down-regulate mRNA level without affecting the survival rate.
Key words: systemic lupus erythematosus;arsenic trioxide;5-azacytidine;interferon-gamma
系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种以自身抗体的产生和T、B细胞过度活化及多种细胞因子异常表达为主要特征的慢性反复性自身免疫疾病。目前SLE病因和发病机制未明，重症狼疮的治疗仍是一大难题。三氧化二砷(ATO)是我国中药砒霜的主要成分，已成功应用于急性早幼粒细胞白血病的临床治疗。我们曾在2001年率先报道ATO对狼疮鼠有治疗作用[1-2]，体内研究已证实ATO能降低MRL/lpr小鼠IFN-γ的血清水平[3]，体外实验亦发现ATO能抑制BXSB狼疮鼠脾组织IFN-γ mRNA的表达[4]。已知SLE患者基因组DNA甲基化程度较正常人降低，故本研究在体外应用甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-AzaC)对MRL/lpr狼疮鼠脾脏CD4+T细胞进行干预，探讨ATO对IFN-γ表达及其mRNA的影响。
1 材料和方法
1.1 药物和试剂 ATO、5-AzaC和植物血凝素P(PHA-P)均购自Sigma公司;白介素-2(IL-2)购自上海华新生物高技术有限公司;RPMI 1640和胎牛血清(FCS)购自Gibco公司;淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司);Dynal Mouse CD4 Negative Isolation Kit(挪威Dynal公司);流式相关的大鼠抗小鼠TH细胞IgG-FITC 购自eBioscience公司;Trizol(美国invitrogen公司);RT-PCR试剂盒(Takara宝生物工程有限公司);ELISA 试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司进口分装产品);2xTaqMan Universal Master Mix(美国ABI公司)。
IFN-γ引物和探针序列参照文献[5]，内参β-actin引物序列：上游 5’-CCTGAGGCTCTTTTCCAGCC-3’;下游 5’-TAGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT-3’;探针序列：5’-FAM-TCCTTCTTGGGTATGGAATCCTGTGGC-TAMRA-3’，均由上海基康公司鉴定合成。
1.2 实验动物 18～20周雄性MRL/lpr狼疮小鼠，体重38～40 g;18～20周C57BL/6J小鼠，体重20～22 g，均由上海斯莱克实验动物有限公司提供并饲养于SPF级。
1.3 细胞培养与处理 每批标本需要4～5只MRL/lpr小鼠或6～7只C57BL/6J小鼠的脾脏。无菌条件下制取小鼠脾脏悬液，进行淋巴细胞分离。免疫磁珠分选脾脏CD4+T淋巴细胞，流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测细胞纯度，台盼蓝染色法测定细胞存活率。细胞存活率=(染色阴性细胞数 / 细胞总数)×100%。CD4+T细胞用10% FCS-RPMI 1640(1 mL/孔)重悬于24孔板，调整细胞浓度为3×106/mL，于37 ℃、5% CO2孵箱继续培养。培养过程中定时观察细胞生长情况，排除细菌生长。
体外经PHA-P(终浓度20μg/mL)和IL-2(终浓度1 000 IU/mL)进行常规刺激48 h后随机进行如下分组，每组设三复孔。(1)不同浓度ATO(0.5、1.0、2.0 μmol/L)作用24 h;(2)1 μmol/L ATO作用不同时间(12、24、48 h)及相应PBS对照组;(3)不同药物处理组：①PBS组：空白对照;②ATO组：1 mmol/L ATO;③5-AzaC组：1 μmol/L 5-AzaC;④ATO+5-AzaC组：1 μmol/L ATO+1 μmol/L 5-AzaC(5-AazC提前72 h加入)，共培养24 h。
1.4 ELISA法检测CD4+T细胞上清液中IFN-γ的水平 收集细胞悬液于Eppendorf管，离心后吸取细胞上清液置于-80 ℃冰箱保存待测。严格按试剂说明书操作，显色后在全自动酶标仪上450 nm波长处读取OD值，通过绘制标准曲线求出指标含量。
1.5 实时荧光定量PCR法检测不同药物处理组中CD4+T细胞IFN-γmRNA的表达水平 细胞匀浆并用Trizol法抽提RNA，采用Takara宝生物工程有限公司的RT-PCR试剂盒进行逆转录反应，然后采用7500 Real Time PCR System(ABI公司)进行IFN-γ和β-actin产物扩增及结果分析。反应体系总体积25μL：上下游引物(20μmoL/L)各0.5μL、Taqman探针(20μmoL/L)0.5μl、样本cDNA 2.0μL、2xTaqman Universal Master Mix 12.5 mL及去离子水9 mL，PCR循环条件设置：50 ℃ 2 min，95 ℃变性10 min后，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min 扩增45个循环。
1.6 统计学处理方法 多组间比较采用方差分析。
2 结果
2.1 不同浓度ATO作用不同时间MRL/lpr小鼠CD4+T细胞存活率比较 在不同浓度ATO(0.5、1.0、2.0μmol/L)作用下，2.0μmol/L组细胞存活率明显下降(见表1)，提示细胞可能发生了凋亡。结合2.2.1 ELISA检测结果(见表3)，我们进一步选用1.0μmol/L ATO分别作用12 h、24 h、48 h，48 h组细胞存活率下降。相应PBS空白对照组中48 h组细胞存活率亦显著降低，且与ATO 48 h组比较差异无显著性(P&>0.05)(见表2)。
2.2 不同培养条件对MRL/lpr小鼠CD4+T细胞上清液中IFN-γ分泌水平的影响
2.2.1 不同浓度ATO对CD4+T细胞上清液中IFN-γ分泌水平的影响：不同浓度ATO(0.5、1.0、2.0μmol/L)作用24 h后细胞上清液中IFN-γ的分泌水平结果见表3(n=4)。ATO 1.0μmol/L组、2.0μmol/L组分泌水平较ATO 0.5μmol/L组和PBS对照组下降，前两者比较差异有显著性(P&<0.05)。
2.2.2 ATO作用不同时间对MRL/lpr小鼠CD4+T细胞上清液中IFN-γ分泌水平的影响：1μmol/L ATO作用不同时间(12、24、48 h)细胞上清液中IFN-γ的分泌水平结果见表4(n=4)。ATO 24 h组、48 h组分泌水平较0 h对照组和12 h组下降，前两者比较差异有显著性(P&<0.05)。
2.3 不同药物处理组MRL/lpr小鼠和C57BL小鼠CD4+T细胞上清液中IFN-γ的分泌水平及mRNA的表达水平 结合2.1和2.2结果，选用1.0μmol/L ATO处理24 h，实验结果见表5、图1(n=6)。1.0μmol/L ATO能降低MRL/lpr小鼠细胞上清液中IFN-γ的浓度及mRNA水平，结果发现：在两小鼠中，ATO+5-AzaC组较ATO组降低，5-AzaC组明显大于PBS组，差异存在显著性。在MRL/lpr小鼠，ATO组表达明显小于PBS组与5-AzaC组(P &<0.01)，而在C57BL小鼠，ATO组与PBS组比较差异无显著性(P &>0.05)。此外，在PBS组中，MRL/lpr小鼠IFN-γ转录和翻译水平均较相应的正常C57BL小鼠升高(P&<0.01)。
3 讨论
SLE中T细胞具有抗原特异性和克隆扩增的特点，并参与发病的各个环节。CD4+T辅助细胞(Th)在SLE的发病过程中发挥一定的作用，有报道认为，SLE活动期全血细胞中IFN-γ(Th1细胞分泌)和IL-4(Th3细胞分泌)的分泌量明显高于正常人，且分泌水平均与SLEDAI(SLE活动性指标)呈不同程度的正相关[6-8]。Hasegawa等[9]研究NZB×NZWF1小鼠(狼疮模型)，认为循环和组织IFN-γ表达增加是导致SLE疾病发展和肾脏损害的重要机制。
Fas基因隐性突变的MRL/lpr小鼠是常用的SLE动物模型之一，其淋巴细胞增生， 全身淋巴结肿大，出现与人类SLE类似的自身免疫综合征：包括产生自身抗体和免疫复合物肾小球肾炎，出现侵蚀性关节炎、高滴度抗ds-DNA和ANA、高丙种球蛋白血症和血管炎等[10]。Bobe等[11]研究提出：ATO能下调MRL/lpr狼疮鼠血清IFN-γ的表达水平，能减少MRL/lpr小鼠皮肤损害、肺部和肾脏的淋巴样浸润、肾小球免疫复合物的沉积，极大地延长生存时间。临床上，ATO已被应用于治疗急性早幼粒细胞白血病，剂量为10 mg/L，血药浓度基本维持在0.5～2.0μmol/L之间[12]。5-AzaC作为常见的甲基化抑制剂，通常被用于体外诱导低甲基化，而且还可能增加免疫系统多肽组分的表达水平。异常T细胞DNA甲基化可能在药物性狼疮和自发性狼疮的发生发展中起作用。将经5-AzaC处理的T细胞转注入动物模型，可以引起动物狼疮样疾病[13]。本课题组已有结果说明ATO能提高MRL/lpr小鼠的脾脏与淋巴结DNA甲基化水平，降低其血清抗dsDNA水平并抑制淋巴组织的增生。基于此，我们选用ATO和(或)5-AzaC对发病期MRL/lpr小鼠脾脏CD4+T细胞进行处理。
ATO浓度维持在0～1.0μmol/L时，细胞存活率差异无显著性(P &>0.05)。同时，ELISA检测结果说明1.0μmol/L ATO可以抑制IFN-γ的异常高表达，而0.5μmol/L ATO则无此抑制作用。因此，我们选用1.0μmol/L ATO继续实验。该浓度ATO作用12 h、24 h时对细胞存活率无影响，48 h组则降低，考虑细胞自身正常死亡可能(与相应空白组比较)。24 h、48 h组IFN-γ表达水平被抑制，由此可知：1.0μmol/L ATO作用24 h无明显的细胞毒作用，该剂量和时间内的ATO对细胞而言是安全的，而且能纠正IFN-γ的异常高表达状态，故可用于下述研究。
本研究结果发现，MRL/lpr小鼠Th细胞IFN-γ的分泌水平及其mRNA水平均显著高于正常对照的C57BL小鼠，提示MRL/lpr小鼠存在免疫异常高表达状态。在MRL/lpr小鼠，1.0μmol/L ATO作用24 h可以抑制IFN-γ的分泌和mRNA表达，提示ATO可能通过影响细胞的分泌功能和细胞因子转录途径来纠正IFN-γ的异常高表达。然而，1.0μmol/ LATO作用24 h并没有对C57BL小鼠IFN-γ的分泌和转录产生影响。故我们推测ATO是在细胞因子异常表达(活化)的状态下发挥作用，对于正常小鼠(非活化状态下)并不起作用，也更进一步说明了该浓度药物的安全性。此外，有研究报道，转录因子STAT4、T-bet等可能参与了IFN-γ的调控，在SLE细胞因子失衡中起重要调节作用。结合本实验结果，ATO是否通过转录因子途径调节IFN-γ的表达仍待进一步证实。
研究表明，5-AzaC可能通过直接抑制DNA甲基化转移酶或与DNA甲基化酶共价结合降低其亲和力，造成T细胞基因组广泛低甲基化，基因表达增加，诱导狼疮的发生。本研究显示：经过5-AzaC预处理的MRL/lpr、C57BL小鼠IFN-γ的分泌水平及其mRNA水平均显著高于各自对应的PBS组，说明5-AzaC能够造成T细胞在体外的自身反应性，在细胞因子表达水平上诱发和加剧狼疮样效应。1.0 μmol/L ATO干预经5-AzaC预处理的细胞24 h后，两种小鼠Th细胞IFN-γ的分泌和mRNA表达均被不同程度的抑制。因此，一方面，我们认为在IFN-γ异常表达加剧的情况下，即细胞因子处于进一步活化状态时，ATO对其表达的抑制作用更加显著，提示和肯定了ATO可能潜在的治疗作用;另一方面，我们推测ATO能通过甲基化途径发挥抑制细胞因子表达的作用，有利于进一步阐明SLE的发病机制。
本实验中ATO能够逆转活化状态下IFN-γ转录和翻译水平的异常高表达，由此我们推测ATO可能主要通过提高甲基化水平而抑制细胞因子的高水平，缓解SLE病情，但是否通过影响IFN-γ启动子甲基化水平以及通过何种途径影响均尚待进一步研究。
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