【摘要】 CCAAT增强子结合蛋白β（CCAAT enhancer binding proteins，CLEBPβ)是转录因子C／EBPs家族的重要成员，其C端具有高度保守的DNA结合域和二聚化功能域。它主要通过对靶细胞基因转录的调节，参与细胞增殖与分化、肿瘤发生与凋亡、细胞周期调控等重要生命活动；其功能受到蛋白酶降解、磷酸化、蛋白质相互作用等多种途径的调控。本文综述有关C/EBPβ的生物学功能及其调控机理近年来的一些研究进展。
【关键词】 C/EBPβ 转录调控 细胞分化 靶基因 磷酸化
Abstract: C/EBP β is an important transcription factor that belongs to C／EBPs(CCAAT enhancer binding proteins)family，whose C-terminal region contains the highly conserved DNA-binding domain and dimerization domain． C/EBP β plays important roles in numerous cellular responses by regulating the transcripition of genes from target cells，including the cell proliferation and diferentiation，tumorgenesis and apoptosis，and cell cycle regulation．The function of C/EBP β is regulated by proteolysis，phosphorylation，and the interaction between proteins，etc．In this paper，the research progress of C／EBP 13 in biology function and regulation will be reviewed．
Key words:C/EBP β; transcriptional regulation; differentiation; target genes; phosphorylation
细胞的增殖和分化是通过特定基因的表达而实现的，其机制离不开转录因子的调控作用。C/EBPβ (CCAAT enhancer binding proteins)是一类与DNA增强子区域结合的反式作用因子，是C/EBPs家族中的重要成员之一。到目前为止，已经发现并且成功克隆了6种人C/EBP家族成员，它们可以以同源或者异源二聚体形式识别并结合靶基因调节元件内的5’- RTTGCGYAAY-3’回文序列，（R 等于 A 或者 G， Y 等于 C 或者T）。从而进一步的调节下游靶基因的表达［1］。现在已经证实，C/EBPβ是人与啮齿动物间进化高度保守的蛋白，其同源蛋白广泛存在于人、猪、鼠、鸡、牛等生物体中，并且在机体各组织中广泛表达，对各种不同细胞信号产生应答而调节相应靶基因的表达。
1 C/EBPβ基因及其产物的结构特征
人C/EBPβ基因位于染色体20q13.1上，无内含子，该基因编码产物为一个由345个氨基酸残基组成的相对分子质量为36 100的蛋白，由于C/EBPβ基因mRNA存在4个转录起始位点，因此该蛋白又存在4种表达亚型，其表观分子量分别为P38，P33，P20和P8.5 KDa，其中P38KDa，P33KDa，P20KDa又分别被称为Liver Activating Protein*(LAP*)， LAP and Liver Inhibitory Protein (LIP)［2］，这些亚型蛋白C端都具有保守的DNA结合域以及二聚化功能域，又称bZIP 结构域；而在蛋白的N端，LAP*，LAP，具有转录结合域，可以特异识别基因启动子区域和上游调控元件。而LIP，和P8.5KDa 2种亚型则没有转录结合域，推测其功能是和LAP或者bZIP家族其他成员形成同源或异源二聚体，影响C/EBPβ对DNA的亲和结合力，竞争性抑制LAP及LAP*的转录活性(图1)
2 C/EBPβ的生物学功能
2.1 C/EBPβ与细胞的增殖分化
2.1.1 C/EBPβ与前体脂肪细胞分化
前体脂肪细胞向脂肪细胞的分化是由一组复杂的转录因子网络调控的，它们控制着成熟脂肪细胞基因表型的上百种蛋白质表达。其中最为重要的被认为是C/EBPs和PPAR转录因子家族。近年来普遍接受的观点是PPARγ和C/EBPα为前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的“终末通路”，它们的表达将直接导致脂肪特异性基因，如422/aP3，Mest/peg1的表达，成熟细胞的基因表型随即形成［3］。有研究表明C/EBPβ能够诱导PPARγ在PPARγ+/-的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中表达进而激活脂肪细胞的分化，而在PPARγ-/-的MEFs中却不能诱导C/EBPα的表达，脂肪分化同时受阻。Zuo［4］等研究发现，PPAR依赖的HDAC1(组蛋白脱乙酰基酶1)被26s蛋白酶降解，导致如图1所示第64位丝氨酸与第188位色氨酸为磷酸化受体结合位点。SWI/SNF：结构域与调节域的不同匹配类型随二聚体与同源DNA结合的复合结构的变化而变化HADC1从C/EBPβ与C/EBPα最小启动子相关复合体中解离。这一过程阐明了PPARγ诱导C/EBPα表达的一种可能的机制，C/EBPβ通过激活PPARγ表达从而启动脂肪细胞的分化，成为前体脂肪细胞分化的一种标准模式，在脂肪细胞的分化中扮演着重要角色，是细胞分化的“必经之路”，C/EBPβ的缺失将直接阻碍脂肪细胞的分化。
图1 (a) C/EBP bZIP二聚体与同源DNA结合的预测结构；(b) C/EBP-b 的转录亚型结构（略）
2.1.2 C/EBPβ与上皮细胞肿瘤的增殖及特性
C/EBPβ参与上皮细胞肿瘤的发生。 Sterneck E等［5］研究了在C/EBPβ敲除的小鼠（C/EBPβ-/-）中，其上皮组织在致癌物质诱导下凋亡效应增强，并表现出对癌组织发生的高抵抗性。相比之下，剔除C/EBPδ后的小鼠对DMBA诱导下的皮肤癌却并不耐受，这更说明了在致癌物质诱导下C/EBPβ在皮肤癌发生过程中起到的重要作用，角质化细胞中C/EBPβ的缺失足以抵抗化学性致癌作用。同时，C/EBPβ也与肿瘤细胞的侵袭和扩散有关。Elafin是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，而丝氨酸蛋白酶在肿瘤的侵袭转移中起到关键作用。O’Brien ［6］等在研究中指出在elafin基因启动子区域存在三个潜在的C/EBPβ结合位点，过表达C/EBPβ可以激活elafin在乳腺癌细胞中表达，使癌细胞侵袭和转移能力增强。RNA干扰实验进一步证明C/EBPβ为elafin表达所不可缺少，并且C/EBPβ与elafin之间存在着某种负反馈回路，C/EBPβ有可能通过上调elafin表达从而抑制肿瘤的侵袭与转移。与此同时，也有学者研究了C/EBPβ在胰腺癌细胞系AR42J-B13血管内转移的作用，发现C/EBPβ转染后的细胞（betaB13）转移效率得到显著提高，肝内分别注射betaB13和空载B13后，通过缺口末端标签分析（Nick-end labeling analysis）发现血管内beta B13细胞呈现明显的低凋亡率，研究表明了C/EBPβ具有增强胰腺肿瘤细胞血源性转移的作用以及明显的抗凋亡效应，并由此提高了血管内肿瘤细胞的存活率。Homma［7］等应用免疫化学技术观察了47例神经胶质瘤组织样本，发现C/EBPβ的mRNA和蛋白量都显著增加，其中高度恶性样本又高于低度恶性样本，并且患者成活率与C/EBPβ的表达量呈正相关，在体外实验中证实了C/EBPβ小干扰RNA可以抑制胶质瘤细胞增殖和扩散，所以C/EBPβ有可能成为治疗该肿瘤的靶点以及评判神经胶质瘤预后的指标之一。
2.2 C/EBPβ与细胞周期
Buck，等［8］发现在HepG2肝癌细胞中过表达C/EBPβ可以使细胞停滞在G1-S期，这种效应需要同时具备bZIP结构域与N-端转录激活序列的存在，对于无活性的剪切体LIP，则不会出现此种效应。Luedde，等［9］分别用LAP和LIP过表达重组腺病毒载体转染体外部分肝切除的肝细胞，发现在肝切除24小时后的advLAP组S期阳性肝细胞与标准对照组相比明显减少，而advLIP组DNA合成峰值并未改变，说明advLIP对G1-S期的过渡影响甚微，而 advLAP则延迟了肝细胞G1期向S期的过渡，同时在advLIP组发现了几种关键的细胞周期标记的表达，如：增殖细胞核抗原（PCNA），细胞周期调节蛋白A，E（cyclinA，cyclinE），这提示了在肝细胞再生过程中LAP/LIP的比值是细胞周期进展的重要因素。异位表达C/EBPβ于原代培养的成纤维细胞中，可以通过一种叫RB-E2F的复合体调控的机制诱导细胞周期的完结，细胞呈现出衰老细胞的形态学改变，过表达原癌基因RAS v12时也可以观察到类似的形态学改变，有趣的是表达RAS v12的 C/EBP-/-纯合子小鼠成纤维细胞（MEFs）却没有衰老表现反而继续增殖，推测是C/EBPβ与RB-E2F复合体通过抑制了S-期某种特异基因的表达来控制细胞停滞在G1-S期之间［10］。因此C/EBPβ被认为是一种由RASv12引导的细胞周期脱离/老化的细胞因子。
2.3 C/EBPβ其他相关功能
C/EBPβ可能参与AIDS的发病过程，Rosati M，等［11］的研究结果表明，增强的 C/EBPβ活性与CCR5阳性的AIDS淋巴细胞呈高度正相关，在CD4淋巴细胞群体中呈下降趋势，推测C/EBPβ在AIDS的发病过程中发挥了相关作用。C/EBPβ调节 HuccT1细胞 Tas/r3甜味觉基因启动子活性，参与味觉的调控［12］。C/EBPβ调节磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）活性，参与机体细胞能量代谢［13］。
3 C/EBPβ功能的调控
3.1 转录与翻译水平的调控
C/EBPβ基因不含有内含子，其转录产物mRNA中具有4个符合读码框的起始密码子AUG，因而含有4种选择性转录起始位点（alternative translational initiation， ATI），通过“核糖体间断扫描机制”可以形成AUG-1，AUG-2，AUG-3，和AUG-4 4个C/EBPβ同型蛋白产物，其中AUG-1，与AUG-2含有N端转录激活域和C端bZIP结构域，可作为转录激活因子参与基因的调控与表达，而AUG-3，AUG-4只含有C端bZIP结构域，因而可与全长型C/EBPβ蛋白结合，发挥竞争性抑制作用，负性调节基因的表达［14］。
3.2 磷酸化作用的调控
C/EBPβ蛋白的特定氨基酸位点可以被磷酸化/去磷酸化，而改变其反式转录的功能与活性，不同的分子信号介导的磷酸化位点各有不同。有研究［15，16］表明C/EBPβ可以与含有cdk8的负性调节复合体结合，RAS信号通过C/EBPβ的DNA 调节域（TMD）MARK保守位点Thr 188的磷酸化，使得此复合体由含有csp70的调节元件所取代，C/EBPβ-cdk8复合体构象发生改变，最终激活C/EBPβ的转录活性。同时学者也发现细胞周期蛋白D1（CyclinD1）在上皮肿瘤细胞中的过表达标记可以减弱C/EBPβ-cdk8-csp70复合体的这种抑制性构象(图2)［17］。
图2 C/EBPβ复合体调节模式图（略）
TGFalhpa诱导的P90核糖体S激酶（RSK）可以使C/EBPβ的N端 Thr217 磷酸化而促进肝细胞的分化增殖［18］。而钙/钙调蛋白依赖性激酶可以使C/EBPβ亮氨酸拉链结构中Ser276 磷酸化而导致C/EBPβ的转录激活和核定位［19］。
3.3 蛋白之间相互作用的调控
C/EBPβ可通过亮氨酸拉链结构与自身或者C/EBPs家族其他成员形成同源或异源二聚体，从而改变其对DNA的结合力与亲和力，进而调节自身及其靶基因的转录活性［20］。尤其是，LAP/LIP的比率常常决定特定基因的表达水平，以及是否增强或受到抑制，C/EBPβ的这一特性说明了其对基因的转录调节的强弱很大程度上是通过这两种蛋白剪切体的相互拮抗而得以实现的［21］。RNA识别基序（RNA Recognition Motif， RRM）家族某些成员如 HuB，在脂肪细胞的分化过程中，它可与C/EBPβ直接相互作用，通过改变LAP/LIP比率来调控细胞的分化与增殖［22］。
3.4 其他相关调控途径
核共活化物P300具有乙酰转移酶活性，它能够对C/EBPβ的多个赖氨酸位点进行转录后修饰，其中lysin 39的乙酰化在C/EBPβ的转录激活过程中发挥重要作用［23］。
小泛素相关修饰因子（Small ubiquitin-related modifier (SUMO)）可以特异识别C/EBPβ中部DNA调节域上 X-lys-Y-Glu 共有基序的赖氨酸残基，削弱了C/EBPβ对原癌基因c-myc的抑制作用，同时诱发C/EBPβ在细胞核中分布状态的改变，这种SUMO介导的C/EBPβ修饰被认为在细胞的增殖与分化平衡上发挥着精细调节作用［24］。
C/EBPβ的激活与内质网压（Endoplasmic Reticulum Stress）有关，已在C/EBPβmRNA编码区下游+1614-1621发现无折叠蛋白（unfolded protein）反应元件（5’-TGACGCAA-3’）.葡萄胎丢失，链霉素等可诱发内质网压升高，大量聚集的未折叠蛋白与C/EBPβ反应元件作用，引发一连串称为 unfolded protein response(UPR)反应来维持细胞的衡定［25］。
近年来，随着对C/EBPβ研究的深入，越来越多的功能正在被人们所认识，C/EBPβ功能广泛，几乎涉及到全身各个系统和组织，其功能的多样化体现在不仅参入细胞分化增殖，肿瘤发生凋亡及造血细胞生成。这些较早被研究的方向，还包括细胞周期的调控，机体能量代谢，激素调节与合成以及生殖系统功能等等这些近来被人们新认识的功能。而这样广泛的功能同样也受到形式多样化的调控，包括与自身及其家族成员形成的二聚体，其中也包括为数众多的辅助因子参入协同调控，如Cyd1，Cdk8，Csp70等等，同时也包括种类繁多的转录后修饰途径，如：磷酸化，乙酰化，以及SUMO介导的C/EBPβ转录后修饰。C/EBPβ通过各种不同的途径应答细胞外复杂多样的信号，从而发挥对其靶基因的调控作用。其中与肿瘤发生发展相关的研究日趋多见，与之围绕相关的细胞调节途径及其信号网络正在逐渐形成。随着进一步阐明C/EBPβ在上皮肿瘤中的双向效应的机制，明确其精细调控机理，C/EBPβ很有希望成为一个新的基因治疗靶点，并且为肿瘤治疗提供新的理论基础和思路。
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