【摘要】 目的 探讨人参皂甙Rg1对脑缺血再灌注大鼠脑组织c-jun N-末端激酶（pJNK）表达的影响及其意义。方法将大鼠随机分为假手术组、单纯缺血再灌注组、人参皂甙Rg1 10、20、40 mg/kg组、尼莫地平1 mg/kg组，采用大脑中动脉闭塞法建立脑缺血再灌注模型，应用免疫组织化学方法检测脑组织缺血再灌注4h后pJNK的表达。 结果 人参皂甙Rg1各剂量组大鼠脑组织pJNK表达阳性率分别为(23.89±6.77)， (15.19±4.59)， (9.15±4.77)，均低于单纯缺血再灌注组 (27.15±8.46)。结论 人参皂甙Rg1防治大鼠脑缺血再灌注损伤的机制可能与抑制脑组织pJNK表达有关，且以高剂量效果较好。
【关键词】 人参皂甙Rg1 脑缺血再灌注 pJNK 大鼠
Abstract: Objective To discuss the effects of Ginsenoside Rg1 on the expressions of JNK in the rats brain tissue after focal cerebral ischemia-reperfusion and its significance. Methods Rats were pided into the sham-operative group， Model group， Ginsenoside Rg1 groups of 10 mg/kg， 20 mg/kg， 40mg/kg， and Nimodipine group of 1 mg/kg at random. The method of middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats was adopted to establish the model of cerebral ischemia-reperfusion， and then the expressions of JNK after cerebral ischemia-reperfusion 6 h was tested based on the chemical method in immunity tissue. Results The positive rate of expression of rats brain tissue in each of the Ginsenoside Rg1 groups is (23.89±6.77)， (15.19±4.59)， (9.15±4.77) respectively. Conclusions The results showed that the mechanism of Ginsenoside Rg1 to protect the brain cells from damage after cerebral ischemia-reperfusion injury may be associated with JNK expression to inhibit brain tissue， and it was more effective when Ginsenoside Rg1 was in high-dose．
Key words:Ginsenoside Rg1; cerebral ischemia-reperfusion; JNK；rat
研究表明，人参皂甙Rg1能通过抑制细胞凋亡对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用，但其抗凋亡的机制还不十分清楚［1］。丝裂原蛋白激酶信号通路(mitogen activated protein kinases，MAPKs)是脑缺血再灌注损伤中主要的信号通路，它包括5个亚家族，其中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNKs)亚家族主要参与细胞凋亡的调控。本实验拟采用免疫组织化学方法检测脑缺血再灌注后大鼠海马CA1区神经元pJNK的表达，并观察人参皂甙Rg1对pJNK蛋白表达的影响，以明确人参皂甙Rg1是否通过JNK信号通路来抑制脑缺血再灌注后的神经元凋亡。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组与给药方法
Sprage-Dawl大鼠，雄性（以排除雌激素影响），体重为250～300 g，随机分为6组：①假手术组；②单纯缺血再灌注组；③～⑤人参皂甙Rg1给药组（10、20、40 mg/kg）；尼莫地平药物对照组（1 mg/kg）；每组5只大鼠。③～⑥组分别于术前5 d至取材当日腹腔注射人参皂甙Rg1、尼莫地平，其余各组分别注射等量等渗生理盐水，1 次/d。
1.2 药品及试剂
人参皂甙Rg1(纯度&>95%)购自吉林大学有机化学教研室；尼莫地平注射液(批号为071001)，购自山西亚宝药业；其它药品均为国产分析纯，由辽宁医学院科学实验中心提供。
1.3 大鼠右侧局灶性脑缺血(MCAO)模型的制备
10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉，采用改良线栓法［2］制备大鼠局灶性脑缺血模型。线栓采用头端光滑烫圆的直径0.23 mm鱼线，长度由右侧颈外动脉分叉部计约（18.5±0.5）mm。栓塞2 h后，将鱼线轻轻拔出并缝合皮下筋膜及皮肤，即为再灌注模型，再灌注时间为4 h。
1.4 免疫组织化学染色及图像分析
MCAO术后6 h，将各组大鼠麻醉，4% 多聚甲醛灌流固定，断头取脑，梯度酒精脱水，定向石蜡包埋切片，厚5 μm。切片常规脱蜡至水，免疫组化Envision法染色：3% 过氧化氢溶液处理15 min以去除内源性过氧化物酶；然后采用pH6.0 枸椽酸缓冲液高压修复抗原，自然冷却至室温后；滴加1∶200 稀释的pJNK单克隆抗体4 ℃孵育过夜；然后滴加辣根酶标记羊抗兔多聚体（PV6001）37 ℃孵育30 min。每步骤之间用0.01 M PBS洗3 次，每次5 min。DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。阴性对照用PBS替代一抗［2］。pJNK蛋白阳性定位于神经元的细胞核，呈棕黄色。
采用CIAS-1000 型细胞图像分析系统进行阳性细胞计数。每例标本等间隔选取切片3 张，每张切片随机选取右侧海马CA1区2 个不重叠高倍视野(400 倍)，计数每个视野下细胞总数及阳性细胞数量，计算表达阳性率=（阳性细胞数/细胞总数）%［3］。
1.5 统计学分析
应用SPSS10.0软件分析，所有数据均用±s表示。多组间差异显著性检验采用单因素方差分析及两两比较的q检验。
2 结果
2.1 pJNK蛋白免疫组织化学定性、定位表达
假手术组大鼠大脑右侧海马CA1区偶见神经元胞核染色；单纯缺血再灌注组可见大量阳性细胞，与假手术组比较有显著差异(P&<0.05)；人参皂甙各组和阳性对照药尼莫地平组能显著降低MCAO大鼠海马CA1区的pJNK阳性细胞数，与单纯缺血再灌注组比较有显著性差异(P&<0.05)；人参皂甙Rg1 10、40 mg/kg组与阳性对照药尼莫地平1 mg/kg组比较均有显著性差异(P&<0.05)，其中40 mg/kg组抑制pJNK表达的程度显著优于尼莫地平1 mg/kg组，而人参皂甙Rg1 20 mg/kg组与阳性对照药尼莫地平1 mg/kg组无统计学差异(P&>0.05)，见表1，图1。
表1 各组大鼠MCAO术后6h右侧海马CA1区pJNK表达阳性率比较（略）
注：与假手术组比较，aP&<0.05；与单纯缺血再灌注组比较，bP&<0.05；与尼莫地平1 mg/kg组比较，cP&<0.05；与人参皂甙Rg1 10 mg/kg组比较，dP&<0.05；与人参皂甙Rg1 20 mg/kg组比较，eP&<0.05
3 讨论
研究表明，脑缺血时组织低氧可使细胞发生坏死或凋亡。JNK家族是MAPK家族成员之一，与细胞凋亡有密切联系［4］。不论是短暂性还是永久性缺血损伤，JNK信号转导通路在神经元中都被激活，从而发挥重要的作用［5-6］。Wang ZQ等利用大脑中动脉永久栓塞(MCAO)模型，证实脑缺血或缺血再灌注后损伤中心脑区JNK的激活主要在损伤后30 min～6 h，以神经元为主，在损伤中心区和半暗带区磷酸化的JNK显著增多［7-8］。
JNK主要表达于胞质内，核内也有少量表达。JNK一旦被激活，称为pJNK，立即从细胞质移位至细胞核，并可引起级联反应，导致其一些作用底物相应激活。首先，pJNK通过对c-Jun氨基末端63与73位的丝氨酸进行有效的磷酸化而激活c-Jun。活化的c-Jun可以聚合成二聚体而形成可以活化的蛋白-1(AP-1)复合物，这种复合物通过与其靶DNA结合相结合激活下级基因而发挥其抗凋亡作用［9］。
本实验结果显示：假手术组有少量pJNK阳性细胞；与假手术组比较，单纯缺血再灌组大鼠海马CA1区神经元可见大量pJNK阳性细胞，差异有统计学意义(P&<0.05)，这一实验结果与以往文献报道基本一致；人参皂甙Rg1三个剂量组与单纯缺血再灌注组比较，pJNK的表达明显减少，提示人参皂甙Rg1具有抑制脑缺血再灌注大鼠pJNK的作用。人参皂甙Rg1 各组分别与阳性对照药尼莫地平组比较，人参皂甙Rg1 10 mg/kg组虽能抑制神经元pJNK的表达，但与阳性对照药尼莫地平组比较仍显著性差异(P&<0.05)，而人参皂甙Rg1 20、40 mg/kg组与阳性对照药尼莫地平组无统计学差异(P&>0.05)，此结果提示人参皂甙Rg1中、高剂量组的效果在抑制pJNK蛋白表达方面具有与尼莫地平相似的效果。本结果提示人参皂甙Rg1具有抑制pJNK蛋白表达的作用，但其能否通过抑制JNK信号通路减少脑缺血再灌注损伤引起的神经元凋亡，以发挥其对缺血性脑损伤的保护作用尚需进一步证实。
参考文献
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