作者：毕聪明，王珅，王军，费东亮，肖银霞
【摘要】 目的 探讨小鼠精原干细胞体外诱导分化精子样细胞的可行性。方法 以7～8日龄小鼠睾丸为材料，采用小鼠睾丸支持细胞作为饲养层，应用维甲酸诱导、成年小鼠睾丸组织液诱导以及低温诱导精原干细胞分化，应用流式细胞仪分析诱导精子样细胞的染色体倍性。采用显微注射法将精子样细胞注射到卵母细胞和去核卵母细胞，观察受精卵的发育状况。结果 三种方法诱导精子样细胞比例分别为5.9%、1.6%、0.35%；流式细胞仪分析维甲酸诱导单倍体比率为19.3%；诱导精子样细胞能激活卵母细胞，囊胚发育率20.36%。结论 新生小鼠精原干细胞体外可以诱导分化为精子样细胞，并具有激活卵母细胞的能力。
【关键词】 精原干细胞 分化 单倍体 小鼠
Abstract: Objective To discuss the possibility of SSCs of Newly-born mice inducing the differentiating Sperm-like cells. Methods Taking the testis of male mice of 7～8 days for material and adopting the testis of mice ， SSCs differentiating were induced by using retinoic acid， tissue fluid of adult mice and low temperature. Flow cytometry was used to analyse the ploidy of chromosome inducing sperm-like cells. Microinjection was used to inject the sperm-like cells into oocytes and enucleate oocytes to observe the development situation of zygotes. Results The proportions of sperm-like cells induced by the three methods were 5.9%，1.6%，0.35% respectively. The rate of Flow cytometry to analyse retinoic acid haploid is 19.3% .The sperm-like cells achieved could activate bovine oocytes by sperm injection (ICSI)， and the development rate of blastosphere was 20.36%. Conclusions SSCs of newly -born mice can be induced and differentiated into sperm-like cells and are also capable of activating oocytes.
Key words:SSCs; differentiating; haploid; mice
在生精过程中，原始生殖细胞在胚胎期迁移到生殖嵴，经有丝分裂，迅速增殖形成精原干细胞（spermatogoial stem cells， SSCs），然后进一步形成精原细胞。吴应积等［1］利用曲细精管体外共培养法长期培养精原干细胞自分化为精子样细胞，另外应用外源基因修饰的雄性生殖细胞系或青春期的精原干细胞也可分化出精子样细胞［2－5］，通过体内移植使无内源性精子的动物产生精子。但在体外研究SSCs诱导精子的很少，某些雄性性原细胞可以直接分化成精原细胞［6］，这提示具有一少部分雄性性原细胞维持在干细胞状态。本实验通过体外诱导新生小鼠SSCs分化为精子样细胞，探讨不同诱导方法的诱导效率；采用显微注射法将精子样细胞注射到卵母细胞和去核卵母细胞，探讨其体外重构胚的发育能力，为SSCs体外分化研究打下基础。
1 材料与方法
1.1 动物与材料
1.1.1 实验动物 清洁级7～8 日龄雄性昆明乳鼠(辽宁医学院实验动物中心提供)。
1.1.2 材料 碘化丙锭（propidium iodide， PI）维甲酸（retinoic acid，RA）、EGF（epidermal growth factor）、二氢睾酮（dihydrotestosterone）、促卵泡生成素（follicle stimulating hormone）均为SIGMA公司产品。
1.1.3 培养液的配制
A 基础培养液 DMEM+10% FBS培养液+6 mM 谷氨酰胺+0.5 mM 丙酮酸钠+0.1%非必需氨基酸+10 ng/mL EGF+10 ng/mL 类胰岛素样生长因子+500 ng/mL促卵泡生成素+133 mIU人生长激素+ 5 mg/mL胰岛素+5 mg/mL转铁蛋白+5 mM维生素A+ 0.1 mM视黄醛+ 0.1 mM睾酮+0.1 mM二氢睾酮+0.01% 核苷+0.5% 青霉素。
B 条件培养液 基础培养液+30% 成年小鼠睾丸组织浸提液。
1.2 方法
1.2.1 SSCs的获取
采用组合酶消化法分离SSCs，采用支持细胞和SSCs共培养的方法培养，接种密度为1.0×105/mL，每周换液体2 次。
1.2.2 SSCs的诱导
A.RA诱导 原代培养用基础培养液，添加10-5 mol/L RA处理48 h，培养4 d，更换为基础培养液，37 ℃培养，定时观察细胞生长状况，显微镜观察照相。
B.条件培养液诱导 原代培养用基础培养液培养，3 d换上条件培养液（50% 细胞基础培养液+50% 睾丸组织浸提液培养液），37 ℃ 培养，每2～3 d半量换液1 次，定时观察细胞生长状况，显微镜观察照相。
C.低温培养诱导 原代培养用基础培养液培养，37.8 ℃培养3 d，然后34.8 ℃继续培养，每2～3 d半量换液1 次，定时观察细胞生长状况，显微镜观察照相。
1.2.3 新生小鼠SSCs向精子样细胞诱导分化检测
A.流式细胞仪分选诱导细胞及DNA倍性分析 根据细胞核DNA含量，利用在碘化丙啶(PI)染色区分RA诱导体系中的细胞群［7，8］。
B.卵母细胞胞浆内授精(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)试验 用浓度为0.2% 的透明质酸酶消化卵丘，去卵丘后选择有第一极体的成熟卵母细胞进行ICSI。对照组用支持细胞作供体细胞重构核移植胚胎和孤雌激活胚胎，显微镜下观察受精卵的发育状况。
C.RT-PCR分析 利用RT-PCR检测新分化的悬浮细胞PRM-2、TP1、TP2这三个单倍体的特异性标志基因，引物设计见表1。PCR扩增采用94.8 ℃ 3 min，94.8 ℃ 1 min，57、58、59.8 ℃(TP2， PRM-2，TP1) 1 min，72.8 ℃ 1 min。用精子作阳性对照，成纤维细胞作阴性对照。
表1 RT-PCR 引物靶基因（略）
2 结果
2.1 不同诱导方法结果
采用三种方法诱导新生小鼠SSCs向单倍体分化，结果在不同时间内均能出现类似精子样细胞和形态较大的圆形细胞，体外诱导培养的新生小鼠SSCs，可以形成具有尾巴的精子样结构细胞，不同方法诱导产生具有尾巴样结构的细胞的时间和比例有一定差异（表2）。
表2 不同方法诱导新生小鼠SSCs形成精子样细胞比例（略）
表中不同肩标代表不同处理间经方差分析比较差异显著（P＜0.05)
2.2 诱导精子样细胞培养特性
2.2.1 RA诱导 SSCs与支持细胞共培养，接种后2～3 h支持细胞开始贴壁，12 h完全贴壁并伸出短伪足，SSCs 24 h后贴于支持细胞表面，但不牢固，轻轻吹打有SSCs游离出来，SSCs开始细胞呈圆形或椭圆形，RA诱导后培养至4 d，许多具有单突起的细胞贴于细胞层上或悬浮于培养液中，形态与具有尾巴的精子细胞相似，其细胞体形态椭圆形、三角形、圆形和梭形。圆形细胞体较小，尾巴较短，这种形状的细胞相对较少（图1A）；椭圆圆形细胞具有单鞭毛或另一端有突起细胞体较大，尾巴细长（图1B），而梭形细胞多出现双突起（图1C），培养7 d，精子样细胞和圆形细胞增多（图1D）。
2.2.2 条件培养液诱导 原代培养用基础培养液培养，支持细胞能迅速贴壁，SSCs贴附于支持细胞表面，4 d后形成克隆突起明显的克隆，加入条件培养液后3 d，在SSCs集落周围，出现圆形或椭圆形的细胞，细胞较SSCs大，部分细胞悬浮，游离的精子很少（图1E），贴壁的圆形细胞摇动培养皿或轻轻吹打即脱离支持细胞。圆形的细胞较多，但具有精子样形态的细胞很少。
2.2.3 低温培养诱导 用基础培养液37.8 ℃培养3 d，有克隆产生，转为34.8 ℃ 继续培养6 d后在集落周围有少量散在的圆形细胞，个别细胞有鞭毛（图1F）。
2.3 流式细胞仪分拣精子样细胞
收集上述诱导产生的悬浮细胞，以未定向诱导细胞作为对照，处理用PI荧光染料染色，流式细胞仪分拣见图2。
细胞进行流式细胞仪分析显示，诱导细胞明显的3类细胞群，在DNA直方图出现了明显三个峰中，包括单倍体细胞峰、二倍体细胞峰和四倍体细胞峰，也可见细胞染色体碎片形成其他小峰。而对照组小鼠成纤维细胞出现2个细胞类群，对照显示出现的2峰为二倍体细胞峰和四倍体细胞峰，对照精子组出现一个细胞峰位单倍体峰，因此认为所收集的悬浮细胞中含有单倍体细胞，约占所有悬浮细胞（检测细胞）总数的19.3%。
2.4 卵母细胞体外显微授精试验
将具有精子样结构的细胞，注入成熟培养24 h未被激获的小鼠卵母细胞的胞质中，对照组注射支持细胞和孤雌胚胎，胚胎发育情况结果如表3。
表3 小鼠卵母细胞体外显微授精胚胎发育结果（略）
表中一列中不同肩标表示经方差分析差异显著（P&<0.05）
表3显示，诱导精子样细胞可以使小鼠卵母细胞卵裂并进一步发育为囊胚，其卵裂率、8/16细胞胚比率高于支持细胞重构胚的卵裂率（P&<0.05），诱导精子样细胞ICSI形成囊胚的能力高于支持细胞核移植重构胚和孤雌激活胚（P&<0.05），图3。
2.5 RT-PCR分析
经过RT-PCR分析，诱导的精子样细胞表达PRM-2（282bp）、TP1（175bp）、TP2（152bp）这三个单倍体的特异性标志基因，见图4。
3 讨论
SSCs来源于原始生殖细胞，来源于胚胎的生殖干细胞可以在体外，经RA诱导形成SSCs，体内移植后，形成的SSCs可在无内源精原干细胞的曲细精管种克隆增殖，直接参与精子发生的减数分裂过程。已有研究证实维甲酸在分化精原细胞中起着一定作用，精原细胞和支持细胞均有RA的核受体，还不清楚RA的促分化作用是直接的还是经由支持细胞间接执行的。本试验用RA诱导SSCs生成精子样细胞，并且用成年小鼠睾丸组织液作为条件培养液同样获得了精子样细胞，成年小鼠睾丸内复杂的促进精子生成的成分可能在体外诱导精子样细胞方面发挥了重要作用。另外，我们低温培养法也使SSCs生成精子样细胞，因为精子的生成在睾丸内，睾丸的温度接近35 ℃，所以模拟精子生成的温度能促进SSCs生成精子样细胞。
流式细胞仪分析细胞的DNA含量，是通过检测插入DNA双螺旋结构碱基对的核酸荧光染料被激发后的荧光强度得以实现。与正常小鼠成纤维细胞位置一致的DNA单峰为DNA二倍体。偏移预期正常二倍体位置5 %的峰应疑为异倍体［9］。流式细胞仪用于睾丸细胞的分拣，即2倍体细胞类群和4倍体细胞类群［10］，而减数分裂过程中，睾丸生精上皮细胞，还含有单倍体细胞。通过流式细胞仪分拣，可以对检测的细胞中是否含有单倍体细胞进行鉴定。本实验利用流式细胞仪测定了体外诱导小鼠SSCs生成精子样细胞的DNA含量，结果表明所获得的诱导细胞含有单倍体细胞，约占检测细胞的19.3%。
体外显微受精试验，将获得的精子样细胞注入成熟卵母细胞胞浆中，观察卵裂状况，可以证明精子生物学活性［11］，本实验检测了SSCs体外诱导精子样细胞在体外受精胚胎的发育能力，诱导精子样细胞激活卵母细胞成功率为71.25%，囊胚发育率为20.36。实验证明小鼠SSCs在体外可以诱导分化为精子样细胞，并且可以激活卵母细胞体外发育到囊胚。（此文图1－4见附页6）（略）
参考文献
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