【摘要】 目的 应用原子力显微镜(Atomic Force Microscope，AFM)观察正常人群的口腔鳞状上皮细胞膜表面超微结构，探讨性别、年龄对人口腔鳞状上皮细胞膜表面超微结构的影响。方法 应用AFM 对健康不吸烟的男性与女性的青年(20～30 岁)、中年(40～50 岁)、老年(60～70 岁)的口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面超微结构进行扫描。应用图象软件分析细胞膜表面的平均粗糙度、峰值、表面积差值，并应用SPSS11.5统计分析软件进行统计分析。结果 同年龄组的正常男性与女性的口腔鳞状上皮细胞在外形上无显著差别。男性与女性口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面平均粗糙度、峰值、表面积差值比较，差异有统计学意义(P&<0.05)。但各年龄组之间细胞膜表面平均粗糙度、峰值、表面积差值比较，差异无统计学意义(P&>0.05)。结论 年龄对人口腔鳞状上皮细胞膜表面结构无影响;性别对人口腔鳞状上皮细胞膜表面结构有影响。
【关键词】 性别;年龄;鳞状上皮;口腔;超微结构;原子力显微镜
Abstract: Objective To explore the influence of gender and age on supermicro-structure of human oral squamouscell membrane. The AFM (Atomic Force Microscope) is used to observe the oral squamous cell membrane surface ultrastructure of normal people. Methods AFM was used in scanning oral squamous ultrastructure of epithelial cell-like of the healthy non-smokers of young men and women (20～ 30y)， middle-aged (40 ～ 50y)， elderly (60 ～ 70y). Analysis system of AFM was applied to measure and analyze all important cell surface targets of an average roughness， the peak (peak count) and the surface area difference. The data of statistical difference of membrane surface roughness average， peak， the surface area difference were analyzed by statistical analysis software SPSS11.5. Results There were no significant difference of oral squamous epithelial cells form of healthy men and women in the same age group. The difference between female and male oral squamous cell membrane surface roughness average， peak and difference of the surface area， has statistical significance (P&<0.05). The cell surface average roughness， the peak and difference of the surface were compared among all age groups but there is no significant difference (P&>0.05).Conclusions Age had no effection on the ultrastructure of normal human oral squamous epithelial cells ，while sex groups had.
Key words:gender; age;squamous cells;oral cavity;supermicro structure;AFM (Atomic Force Microscope)
口腔是一个易受性别、年龄等多种理化因素影响的环境，口腔粘膜鳞状上皮细胞在各种因素的持续刺激作用下易发生细胞膜、细胞质、细胞核的形态及结构的多种变化，导致凋亡、降解、甚至癌变。原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，简称AFM)，一种能显示物体表面超微结构的高精密度观测仪，它在应用一根极尖锐的氮化硅探针扫描样本表面时，通过激光的会聚与反射，将物体表面的形态信息传递至监视器，然后由相连的计算机处理成像[1]。在多功能AFM 中有一种特殊的“接触”模式，测量时仪器上的探针处于振荡状态，AFM的这种模式能提高显微镜对表面起伏中侧面形态的解析度，从而描绘出样本表面原子级分辨率的三维图像。目前国内外文献中性别、年龄对人口腔粘膜鳞状上皮细胞膜表面超微结构影响的研究报道较少，本研究通过应用AFM观察正常人群的口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面超微结构，探讨性别、年龄对人口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面超微结构的影响。
1 材料与方法
1.1 主要材料与仪器
原子力显微镜：型号为Nanoscope Ⅲa(Digital Instruments Inc.，Santa Barbara，CA);NSC-11型针尖;超净工作台;(北京半导体设备厂)离心机;漩涡混合器。
1.2 研究对象
武警总医院口腔科就诊的无口腔粘膜疾患或病史，口腔内无局部刺激因素，全身无放射性或有毒化学物质接触史的不吸烟的健康男性与女性。按性别、年龄分为男性青年(20～30 岁)、女性青年(20～30 岁)、男性中年(40～50 岁)、女性中年(40～50 岁)、男性老年(60～70 岁)、女性老年(60～70 岁)6 组，每组各20 例。
1.3 AFM标本的制备
检测者清水漱口3次后，用消毒的木质压舌板从侧面轻刮两颊黏膜，将第2 次刮取物用2%甲醛溶液冲洗入5 mL 离心管内固定15 min，然后1 000 r/ min 离心10 min ，弃去上清液，重复1 次，然后将细胞悬液涂于洁净的载玻片上，置于超净工作台晾干。每次扫描图片前蒸馏水反复冲洗细胞涂片，置于超净工作台晾干后再使用。
1.4 AFM操作方法
将晾干的样本置于AFM载物台上，利用Nikon倒置显微镜观察细胞的分散情况，选择细胞进行扫描，在大气和室温下进行AFM下的直接观察。选择Tapping模式，调整激光与针尖重合，并将探测器的激光光斑置于中心圆点。在操作软件中进行自动调频，调节探针，直至针尖接触到样本，开始扫描。此时计算机会显示该细胞相应的图像，图像采集为接触模式(Tapping mode)。所有采集图像均通过自动平滑(Flatten auto)处理，以消除慢扫描方向的低频噪音。每个样本扫描20个细胞，扫描范围为70 μm～500 nm，扫描频率为0.5～2 Hz。选细胞膜表面颜色最亮、突起最大最密集的区域测量，所选细胞测量范围均为1 μm，每一例各测量300个区域。并利用AFM图象分析软件对每个1 μm区域的平均粗糙度、峰值、表面积差值进行分析。并获取3种参数的具体测量值。
1.5 统计方法 采用SPSS13.0软件对多组间比较进行方差分析及q检验，两组之间采用t检验。
2 结 果
2.1 细胞形态的原子力显微镜观察结果
原子力显微镜下同年龄组的男性与女性的口腔鳞状上皮细胞在外形上无显著差别，多呈扁平状，椭圆形或多角形，有时在细胞的中央区有一较小的亮斑，可能为细胞核所在的区域。随着年龄的增长口腔鳞状上皮细胞形态发生轻微改变，外形逐渐不规则。
2.2 细胞膜表面超微结构的原子力显微镜观察结果
原子力显微镜下的口腔鳞状上皮细胞膜表面由圆形、椭圆形等大小较一致的隆起组成，各隆起结构相互靠近彼此间形成缝隙状凹陷。隆起结构饱满、光滑，排列疏密程度适中。男性口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面隆起大而少，隆起之间形成的凹陷宽而浅(如图1-3)。女性口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面隆起小而多，隆起之间形成的凹陷也较男性窄而深(如图4-6)。随着年龄的增长口腔鳞状上皮细胞外形逐渐不规则。细胞膜表面的隆起增大，排列逐渐欠规则，偶有融合，各隆起之间的凹陷更宽大、表浅。
2.3 细胞膜表面超微结构的数据测量及统计分析结果
利用AFM图像分析软件对不同年龄组的男性与女性的口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面平均粗糙度、峰值、表面积差值进行测量，每组选择400 个细胞的各1 μm区域。全部数据资料按性别、年龄分组，采用SPSS 11.5 软件进行处理。所有资料进行正态分布检验。各组测定数据以(±s)表示，若服从正态分布且方差齐性，差异以多因素析因分析进行比较; 同性别各年龄组间的差异采用单因素方差分析，同年龄性别分组间的差异行t检验。检验水准α=0.05(表1-3)。表1 不同性别、不同年龄组细胞膜表面平均粗糙度(nm)的比较同年龄组的正常男性口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面平均粗糙度均较女性低(P&<0.05)。随着年龄的增长细胞膜表面平均粗糙度增加，但差异无统计学意义(F=39.114，P&>0.05)。表2 不同性别、不同年龄组细胞膜表面峰值(nm)的比较
同年龄组的正常男性口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面峰值均较女性低(P&<0.05)。随着年龄的增长细胞膜表面峰值增加，但差异无统计学意义(F=23.142，P&>0.05)。表3 不同性别、不同年龄组细胞膜表面表面积差值
同年龄组的正常男性口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面表面积差值均较女性低(P&<0.05)。随着年龄的增长细胞膜表面表面积差值增加，但差异无统计学意义(F=55.101，P&>0.05)。
3 讨 论
Singer和Nicholson 于1972 年提出细胞膜的液态镶嵌模型(fluid mosaicmodel) [2] ，这一假想模型的基本内容是:膜的共同特点是以液态的脂质双分子层为基架，其中镶嵌着具有不同分子结构、生理功能各异的蛋白质。 膜蛋白的聚集在细胞膜表面的凸卢和凹陷结构的形成上起着非常重要的作用[3] 。如果细胞膜的功能有所改变，那么膜蛋白聚集在细胞膜表面的凸卢和凹陷结构也会有所改变。细胞膜不单是细胞的物理屏障，与细胞的各种生命活动如免疫应答、物质运输、信息传导、衰老及病变等都有密切的关系。由于细胞外部信号无论是作用于细胞核的信号，还是作用于细胞核外的信号，它们的传递都必须经由细胞膜，与细胞膜表面的受体结合，或经过细胞膜表面的特殊部位，如膜通道，进入到细胞内发挥作用。雌激素是一种重要的女性激素，主要由卵巢分泌产生。迄今为止发现了两种雌激素受体：雌激素受体α和雌激素受体β，两种受体由不同的基因编码，具有高度同源性[4，5]。近年来，随着雌激素受体(estrogen receptor，ER)在生殖器官外的组织内被发现，对雌激素的功能有了新的认识，其对口腔黏膜的影响也渐渐引起了学者的关注，更有学者[6，7]分别通过免疫组化、原位反转录多聚酶链式反应等方法在人颊黏膜、唇腺、腭腺及腮腺检出了ER。女性的口腔黏膜有雌激素受体，那么女性的口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面，就应该有特异的通道蛋白质完成雌激素跨膜信号传递，从而女性膜蛋白聚集在细胞膜表面的凸卢和凹陷结构与男性将有所差异。本实验通过原子力显微镜的观察与分析，发现女性与男性口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面超微结构的有所不同，女性口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面隆起小而多，隆起之间形成的凹陷窄而深，而男性口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面隆起大而少，隆起之间形成的凹陷也较女性宽而浅。女性口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面平均粗糙度、峰值和表面积差值均较男性高。对不同性别组的细胞膜表面平均粗糙度、峰值和表面积差值的统计分析发现性别对人口腔鳞状上皮细胞的影响有明显意义，我们推测这可能与女性口腔黏膜鳞状上皮细胞存在雌激素受体具有相关性。
以往关于年龄与细胞间的研究多在染色体突变，细胞代谢、基因缺失、修复能力的下降等方面，而关于年龄与细胞膜表面超微结构改变的研究未见报道。为此我们对不同年龄组的不吸烟的健康男性与女性的口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面进行了观察。人在不发生疾病的情况下随着年龄的增长而逐渐呈退行性改变，主要是组织细胞的结构和功能衰退导致人体的整体及相应的器官出现生理性衰退，即细胞膜、细胞核的结构和功能的衰退导致人体的整体及相应的器官出现生理性衰退。如果细胞膜的功能有所衰退，那么就应该是由膜蛋白聚集在细胞膜表面的凸卢和凹陷结构的改变导致膜蛋白的功能衰退而引起的。我们利用AFM观察与分析发现，随着年龄的增长口腔鳞状上皮细胞细胞膜表面膜蛋白聚集在细胞膜表面的凸卢和凹陷结构有所改变，细胞膜表面的隆起增大，排列逐渐欠规则，偶有融合，隆起结构欠饱满、欠光滑，排列疏密不均，各隆起之间的凹陷更宽大、表浅，细胞膜表面平均粗糙度、峰值和表面积差值增加。生理性衰退只是一种渐进性的功能的衰退[8]，那么细胞膜表面膜蛋白结构的改变也应该是一种渐进性的、细微的改变，不会出现较大的差异。对不同年龄组的细胞膜表面平均粗糙度、峰值和表面积差值的统计分析发现年龄对人口腔鳞状上皮的影响无明显意义，我们推测这可能与细胞的生理性衰退只是一种渐进性的功能的衰退具有相关性。
细胞表面膜蛋白结构极其复杂，编码了蛋白组基因的30%[9]。AFM的出现为我们对膜蛋白结构的认识提供了可拓展的空间。蛋白质分子在脂质上有规律地排列或者能在膜上形成二维晶体，均适合于用A FM 研究。各种细胞有各自的膜蛋白，这些膜蛋白有各自独特结构，特别是脂质与蛋白质的比例有很大的差异，因而各种生物膜各有其特殊功能[10]。本课题组已经利用AFM建立了人体尿液的观察方法[11]，且成功的筛选出可以作为生物学和医学样本的基础——进行稀释、固定和保存的缓冲液[12，13]，在此基础上首次运用AFM观察了人体的正常肝及肝癌的活检组织标本[14]，建立了细胞膜蛋白质库，为临床诊断肿瘤奠定了深厚的基础。
(此文图1-6见附页2)
参考文献
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