【摘要】 表遗传学是研究在DNA序列没有改变的情况下，所发生的可遗传性基因表达的改变，其中DNA甲基化是研究最多、最深入的一种表遗传学表达机制。CpG 岛是人类基因组中富含CpG 二核苷酸的DNA 序列，主要位于基因启动子区，大小约为100～1 000 bp，与约60%的编码基因相关。DNA 中CpG 岛甲基化可导致抑癌基因的表观遗传学转录失活，直接参与肿瘤的发生机制。我们简要综述了DNA 甲基化在胃癌中的研究进展。
【关键词】 肿瘤抑制基因;DNA甲基化;胃癌
Abstract:Epigenetics is the study of genetic changes in gene expression without the sequence change of DNA， in which DNA methylation is one of the most widely studied epigenetic mechanism. CpG island is the sequence of human genome， located mainly in the promoter as well as the first extron regions. The size of it is nearly 100～1 000 bp and it links with 60% of human coding genes. Methylation of CpG sites in the promoter regions of genes can lead to decreased expression and silence the tumor suppressor genes and contribute to oncogenesis. The research development of DNA methylation in gastric carcinoma was reviewed in this article.
Key words：tumor suppressor genes; DNA methylation;gastric carcinoma
胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一，发病率高，据统计，其死亡率居全球恶性肿瘤死亡率的第二位，严重的危害着人类的健康和生命。胃癌发生的机制目前仍不是很清楚，研究表明，细胞无限增殖及分化受阻是肿瘤发生的基本过程，随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展，人们逐渐深化了对肿瘤发生学的认识。近年研究结果显示肿瘤的发生是多基因异常共同作用的结果，包括癌基因活化和肿瘤抑制基因失活，有关表遗传学研究显示[1]，表遗传学异常参与了肿瘤发生过程，而且在某种肿瘤的发生中起重要作用，其中DNA异常甲基化可致基因表达减弱或基因沉默，是导致肿瘤抑制基因失活的重要机制之一。本文就胃癌的发生发展过程中一些肿瘤抑制基因DNA异常甲基化研究进展作一综述。
1 DNA甲基化及其作用
表遗传学(epigenetics)是1939年由waddington首先提出的。表遗传学是研究在DNA序列没有改变的情况下，所发生的可遗传性基因表达的改变[1]168-174。其中包括DNA甲基化、基因组印记、染色体组蛋白修饰、隔离蛋白以及非编码RNA调控等方式，这种模式传递给子代细胞是不依赖DNA序列的。其中DNA甲基化是研究最多、最深入的一种表遗传学表达机制。
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases DNMTS)的介导下，二核苷酸中胞嘧啶(C)的第5位原子上的H被S—腺苷甲硫氨酸提供的甲基取代，使之变成5—甲基胞嘧啶(5-methy1cytosine，m5C)[2]的化学修饰过程。甲基化酶包括维持甲基化转移酶(DNMT 1) 和重新甲基化酶(DNMT 3a，DNMT 3b)。维持甲基化酶的作用是识别子代DNA 双链中亲代单链上已甲基化的CpG 位点，催化互补单链的胞嘧啶(C) 发生甲基化;重新甲基化酶的作用是使非甲基化的双链DNA 发生甲基化的过程[3] 。DNA的甲基化修饰反应主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶，CpG 位点以两种形式存在，一种为分散于DNA中，正常情况下这些 CpG二核苷酸甲基化可作为一种宿主基因的保护机制，它会抑制重复子转录以及重复子同源性重组，还可以抑制“寄生”DNA序列(如逆转录病毒片段)的侵入;另一种是CpG 结构高度聚集在一起，即CpG 岛(CpG island)。CpG岛在基因组内呈不连续分布，通常位于基因的启动子区域(promoter region)，也可位于第一外显子区域， 故又称5′-CpG 岛[4]。在正常细胞中，CpG 岛通常不发生甲基化修饰，而肿瘤组织常发生其相关基因启动子区域的异常甲基化。DNA 甲基化异常可分为甲基化增强、甲基化减弱和甲基化转移酶水平增高三种情况，其中抑癌基因甲基化增强在肿瘤中最常见。可通过改变基因的构型或与核内甲基化CG序列结合蛋白结合，阻止转录因子与基因形成转录复合物，从而导致其表达沉默，使肿瘤抑制活性丧失，被认为是肿瘤抑制基因失活的重要途径。另外，DNA 的甲基化还可促进肿瘤相关基因突变，因5-甲基胞嘧啶可自发性或在SAM 作用下引起邻位脱氨转变为胸腺嘧啶，使甲基化的CpG 突变为TpG，因此其也是甲基化促进恶变的机制之一。
CpG岛甲基化是一种基因外修饰，在正常细胞中基因的甲基化大多发生在其启动子CpG 岛之外，而在肿瘤细胞中某些抑癌基因的CpG岛甲基化则导致该基因转录失活，故在肿瘤研究中检测基因启动子区CpG 岛甲基化状态，对于阐明肿瘤发生、发展的机制及建立早期诊断方法均具重要意义。目前DNA甲基化的检测方法比较多，其中广泛应用的技术是甲基化特异性的PCR技术(MSP)和甲基化敏感的单碱基延伸技术(Ms-SNuPE)，这些技术的敏感性高，特异性强，适用于微量DNA或石蜡包埋DNA。在MSP技术的基础上，又先后发展了基于荧光检测方法的实时定量PCR(MethyLight)和依赖于限制性核酸内切酶的甲基化分析方法(COBRA)，这些技术提高了检测的敏感性，实现了高通量和高特异性。此外，有人将MSP技术与变性高效液相色谱法(DNPLC)相结合，来测定整个CpG位点的甲基化。近年，中国科学院化学研究所与清华大学的研究人员合作，发展了基于水溶性阳离子型共轭聚合物的新DNA甲基化分析方法。通过荧光共振能量转移技术(FRET)研究了质粒和人肿瘤细胞p16基因启动子区特异CpG位点的甲基化状态该技术具有较高的灵敏度和特异性。引物无需荧光标记，检测在均相溶液中进行，无需分离、纯化等手段，而且与高通量分析兼容，在癌症临床诊断上具有潜在的应用价值[5]。
2 胃癌相关基因的甲基化
近年研究结果显示，多种基因的异常甲基化在胃癌发生发展中起着重要的作用。有研究[6]表明，DNA的甲基化率在胃癌前病变转化为癌的过程会发生改变。Kang等[7] 对非肿瘤胃黏膜和胃肿瘤进行p16、hMLH1、DAP—kmase、THBS1、及TIMP-3等5种基因检测，发现除DAP—kmase甲基化的频率相近之外，其他基因从慢性胃炎到肠化生及从腺瘤到腺癌甲基化频率都有不同程度的增高。因此认为，这些基因的高甲基化在胃癌变发生过程中的较早阶段就已出现，这为胃癌的早期诊断提供了新思路。
2.1 p16基因甲基化
p16基因又称多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor，MTS)，定位于9p21 位点，由2个内含子和3 个外显子组成。该基因编码的蛋白是一种重要的细胞周期负调控蛋白，可与D型细胞周期蛋白(cyclinD)竞争性结合细胞周期蛋白依赖激酶CDK4 和CDK6而抑制蛋白激酶活性，使肿瘤细胞周期调节中抑癌基因Rb的表达产物(PRb)不能磷酸化而保持活化状态，抑制转录因子EF解离，使细胞周期进展最关键的G 1/S转换停滞，对细胞周期起负调控作用。因此，p16 基因的变异或其蛋白的失活会导致cyclinD-CDK4/6-pRb-E2F调节途径的失控，而使细胞过度增殖，导致肿瘤发生。目前研究表明p16基因的纯合缺失和点突变异常多种肿瘤的发生有关。在胃癌中p16基因异常甲基化主要发生在外显子1和启动子区域，且基因启动子的高度甲基化更为常见。Lee等[8]最早报道了p16 甲基化与胃癌的关系，他们用甲基化敏感性限制性内切酶研究了9 个胃癌细胞株，发现2个细胞株有甲基化，而且不表达p16mRNA;体外以去甲基化剂5-deoxy-ezecytidine对胃癌细胞系处理后，因CpG岛异常甲基化而封闭的基因又重新表达。Ficorella 等[9]发现原发性胃癌中p16 基因启动子区域高甲基化是导致其转录失活的重要原因。Bai等[10]利用诱发Wistar 大鼠胃癌模型研究发现，在大鼠胃黏膜向胃癌演变过程中，p16 基因甲基化是在胃癌发生过程的较早阶段出现，其甲基化的频率在正常胃上皮中为2.7%， 在慢性萎缩性胃炎中为16.7%，在肠上皮化生中为37.5%，在胃腺瘤中为64.7%，在胃癌中则高达82.5%。Abbaszadegan 等[11]通过MSP 和免疫组化等方法同时对52 例胃癌患者组织和血清中p16基因甲基化及蛋白表达情况分析后，认为p16 启动子区高甲基化在胃癌发生中起重要作用，并且与胃癌恶性程度相关。同时提出血清中DNA 甲基化水平的检测可能是胃癌早期检查的一个重要的生物学指标。
2.2 DNA错配修复基因(MMR)、CpG甲基化表型(CIMP)与胃癌
研究发现，在胃癌的发生中存在微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)和 CpG甲基化表型(CpG island methylator phenohype，CIMP)两种分子途径。在DNA MMR中起主要作用的是基因hMLH1 和hMSh3。MMR通过修复DNA碱基错配、降低自发性突变，而增强DNA的保真性和维持基因组的稳定性。Herman等[12]最早报告了在结直肠癌中MMR hMLH1失活与DNA甲基化有关，后来发现胃癌中同样存在微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)亚型，但还没有胃癌中有关DNA MMR发生突变的报道。Fleisher 等[13]检测了65 例胃癌组织的hMLH1甲基化情况发现，随着胃癌中MSI频率的降低hMLH1基因的甲基化率也随之降低。由此推测，hMLH1基因启动子区域甲基化与MSI有关，有可能是该基因失活的一种普遍机制。Poplawski等[14]通过甲基化敏感限制性内切酶PCR(MSRE-PCR)对比分析27例胃癌患者与25 例健康人后认为，hMLH1 甲基化对胃癌形成有促进作用。由此可见，hMLH1启动子的甲基化与胃癌的发生有关，可能是胃癌发生机制中的早期分子事件。
CpG甲基化表型(CIMP)是指一些病例同时存在多个基因甲基化的现象。CIMP已在大肠癌、肝癌、肝内外胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、急性髓性白血病、膀胱癌等恶性肿瘤中得到证实。由于胃癌的发生是一个多步骤、多因素相互作用的结果，也涉及许多相关基因的异常表达，因此多基因的启动子甲基化的研究也就自然得到了研究人员的青睐，而且越来越多的研究发现CIMP与胃癌有着密切的关系。Kim等[15] 通过检测40例早期胃癌组织中hMLH1、TIMP3、THBS1、DAP—K、GSTP1、APC和MINT2的甲基化状况发现，除了2 例基因甲基化阴性外，CIMP尽然高达40%。可见，启动子甲基化在早期胃癌中是一种普遍现象。同时研究还发现，在肿瘤发生的不同阶段、不同基因的启动子甲基化表达状况是不同的，有的基因随胃癌的进展其甲基化发生率有不断升高的趋势，而在健康青年人标本及胎盘中未发DNA甲基化。可见CIMP在胃癌的发生中是一早发事件，可以利用此特征作为胃癌的早期诊断指标，同时对建立胃癌相关基因的甲基化谱也具有积极的作用。
APC 基因是一种抑癌基因，编码的APC蛋白可以抑制上皮细胞增殖而抑制肿瘤的发生。早期研究证实该基因是结直肠癌的管家基因，近来研究发现该基因在胃癌的发生发展中也起重要作用。曾有学者用免疫组化方法分析了120 例胃癌病人的APC基因的表达情况，结果发现，APC缺失率为78%，因此认为APC 基因缺失可能与胃癌的发生有关。近年来大量的研究显示APC基因启动子1A部位甲基化与胃癌发生关系密切。Hosoya等[16]研究发现APC基因启动子1A蛋白表达率与甲基化率在正常胃粘膜和非癌粘膜中保持一致，在癌粘膜中甲基化率增高。而1B均未发现有甲基化。由此可见，ACP启动子甲基化主要发生在1A部位，且ACP启动子1A部位的甲基化可能是胃癌发生的一个中间环节，而不是胃癌发生的始动因素。3 结 语
通过对胃癌相关基因甲基化分析发现，多种相关基因甲基化是胃癌形成的重要机制之一。DNA甲基化异常不仅可在手术标本中检测到，还可从各种体液如外周血清中检测到，为临床应用带来极大便利，因此肿瘤相关基因启动子甲基化状态是一种非常有前途的生物标记物，可作为肿瘤的敏感性生物标志物。检测胃癌相关基因启动子异常甲基化不仅可用于高危人群监测、肿瘤风险评估、胃癌早期诊断，还可用于判断肿瘤迁移情况，预测胃癌手术、放化疗疗效等。由于DNA甲基化是一个可逆的过程，故通过恢复仅被抑制而未发生突变或丢失的生长调控基因表达.来恢复细胞正常生长调控功能，并且已有这方面的动物模型研究证实了这一想法。故DNA的去甲基化将为癌症的治疗提供新思路。由于一些病原体的感染可以诱发肿瘤相关基因甲基化从而导致胃癌的发生，故预防感染和及时的根除这些病原体会对预防胃癌的发生有重要的意义。
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