重组鼠IL28的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

　　　　 作者：袁利学，刘洋，步雪峰，郑金旭，严玉兰

【摘要】 目的： 获取重组鼠IL28（mIL28）纯化蛋白，制备多克隆抗体。方法： 用PCR技术扩增鼠IL28成熟蛋白的编码序列，克隆入原核表达载体pET30，构建融合表达载体pET30amIL28，转化大肠埃希菌BL21（DE3），以IPTG诱导表达IL28融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，然后免疫6～8周龄鸡，制备多克隆抗体，采用ELISA 检测抗体效价。结果： 成功构建了表达载体pET30amIL28，DNA序列测定结果与预期结果一致。在37℃培养条件下，IPTG诱导表达的IL28融合蛋白进行SDSPAGE电泳分析，发现其与融合蛋白的理论计算值一致，免疫鸡后收获抗血清， ELISA 显示抗体效价具有高度特异性。结论： 获得了重组鼠IL28纯化蛋白，制备了鼠IL28多克隆抗体，为进一步深入研究IL28的生物活性及其应用打下基础。

【关键词】 白细胞介素28； 大肠埃希菌； 蛋白质纯化； 抗体制备

　　［Abstract］Objective: To obtain purified recombinant interleukin28 of mouse(mIL28) and prepare its polyclonal antibody. Methods： The cDNA fragment coding for mature mIL28 protein was amplified by PCR and cloned into vector pET30 to construct fusion expression vector pET30amIL28.After pET30amIL28 was transformed into E.coli BL21(DE3)， the bacteria were induced by IPTG.The expressed mIL28 fusion protein was purified by NiNTA affinity chromatography.Six to eight weeks old chickens were immunized with the purified protein for obtaining the antiserum.The titers of antibodies were measured by ELISA. Results： The DNA sequencing showed that the expression vector pET30amIL28 was constructed successfully．After induced by IPTG，the expressed mIL28 fusion protein in E.coli cultured at 37℃ appeared a single band on SDSPAGE．The result of ELISA indicated that the prepared polyclonal antibody had high titer and specificity. Conclusion： The purified recombinant interleukin28 of mouse and polyclonal antibody have been acquired.

　　［Key words］ interleukin28；Escherichia coli；protein purification; antibody preparation

　　2003年， Sheppard 等［1 ］ 和Kotenko 等［2］先后报道了一组新型的白细胞介素IL28A，IL28B，IL29（又称为IFNλ2，IFNλ3，IFNλ1），其中IL28A和IL28B合称IL28。IL28在结构和（或）功能上与IL10家族和I型干扰素（IFN）家族相似，因与IFN家族更接近，所以有学者将其命名为Ⅲ型干扰素。小鼠的 IFNλ 家族仅发现 2个成员，即IL28A和IL28B ［3］。

　　本实验在克隆全长鼠IL28 cDNA 的基础上，构建了重组鼠IL28的原核表达载体，在大肠埃希菌中进行表达、纯化，为进一步深入研究IL28的生物活性及其应用打下基础。

1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　含全长鼠IL28编码序列的质粒PMD18T VectormIL28由本室构建；E．coli NovaBlue，E.coli BL21(DE3)均由本室保存；实验用6～8周龄鸡由南京农业大学提供；各种限制性内切酶购自美国New England Biolabs公司；Hotstar Taq DNA聚合酶、胶回收试剂盒(QIAquick GelExtraction kit)购自美国Qiagen公司；pET30载体、NiNTA HisBind树脂均购自美国Novagen公司；蛋白质分子质量标准及SDSPAGE材料购自美国BioRad。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 表达载体的构建

　　以已构建的质粒PMD18T Vector mIL28为模板，上游引物：TTGAATTCCCTGTCCCCAGGGCCACCAG，下游引物:CTCGAGTCAGACACACTGGTCTCCACTGGCCACACAC，上游引入EcoRⅠ位点，下游引入XhoⅠ位点，通过PCR扩增鼠IL28的成熟蛋白序列，PCR循环条件为：95 ℃ 热启动预变性5 min，95 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共30循环，最后72 ℃延伸 10 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收试剂盒回收。用T4 DNA连接酶将上述PCR产物与PMD18T Vector连接并转化至感受态大肠埃希菌DH5a。挑取阳性克隆扩增后，提取质粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后测序。将PMD18T VectormIL28鉴定正确的阳性质粒及原核表达载体pET30分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切处理，回收片段与载体，用T4 DNA 连接酶连接并转化至感受态大肠埃希菌DH5a。取阳性克隆扩增后进行EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定，酶切产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析。

　　1.2.2 工程菌的诱导表达

　　将重组阳性质粒pET30amIL28转化至大肠埃希菌感受态BL21中，挑取单菌落接种于LB液体培养基中（卡那霉素终浓度100 μg/ml），于37℃活化过夜（14～16 h）后，按1∶100的比例接菌，即50 μl 加入含5 ml的LB的试管中（卡那霉素终浓度100 μg/ml），37℃振荡培养约3 h至D(600nm)值为0.4～0.6时，加入1 mmol/L IPTG诱导表达3 h。取菌体1 ml， 离心12 000×g 30 s收获沉淀，用100 μl 1%SDS重悬，混匀， 煮沸10 min。12％SDSPAGE电泳分析，电泳完毕后，用0.25%考马斯亮蓝染色液染色2 h，脱色，观察电泳结果，蛋白质大小参照低分子质量蛋白标准。

　　1.2.3 重组鼠IL28成熟蛋白的纯化

　　取培养过夜的工程菌 1∶100稀释于 LB培养基中，置37 ℃振荡培养大约 3 h至D(600 nm)为0.4～0.6，加入 1 mmol／L IFFG 30℃诱导表达3 h后，取200 ml细菌培养物5 000 r/min离心10 min，沉淀重悬于8 ml Denaturing Binding 缓冲液，室温缓缓摇动5～10 min， 将其置于冰上超声30 min，超声10 s，暂停10 s。将裂解物5 000 r/mim离心15 min，收集上清，然后按NiNTA HisBind Resin说明书操作，重复操作2次，对可溶性表达蛋白进行纯化，将上柱前裂解液、上柱后裂解液进行SDSPAGE分析。

　　1.2.4 重组鼠IL28成熟蛋白的透析复性

　　剪取适当长度透析袋。在大体积2％（W/V）NaHCO3和1 mmol/L EDTA（pH 8.0）中煮透析袋10 min。用蒸馏水彻底清洗透析袋。将其在1 mmol/L EDTA（pH 8.0）中煮沸10 min。用蒸馏水彻底清洗透析管后将蛋白液装入其中，扎紧两头依次在6 mol/L尿素、4 mol/L尿素、2 mol/L尿素、PBS中透析12～24 h（整个透析过程应4 ℃进行，防止蛋白析出）。

　　1.2.5 动物免疫

　　取纯化的大肠埃希菌表达的重组鼠IL28蛋白，按每只300 μg的剂量与等体积的弗氏完全佐剂乳化，经胸部和腿部肌肉免疫6～8周龄鸡，以后每隔3周再用弗氏不完全佐剂乳化的同剂量鼠IL28蛋白按同样方法加强免疫2次，同时于腋下静脉采血，用ELISA方法测定血清效价以确定免疫效果。

　　1.2.6 ELISA方法测定多克隆抗体效价

　　将纯化的重组蛋白稀释为1.0 μg/mL作为包被抗原，鸡抗血清倍比稀释作为一抗， 免疫前鸡血清作为阴性对照，羊抗鸡IgGHRP为二抗，加入显色液，终止反应。BioRad 450 全自动酶标仪测定各孔在450 nm 的光密度（D）值，以P/N＞2.1 且P-N＞0.2所对应的最大抗体稀释倍数为抗体效价。

2 结 果

　　2.1 表达载体的构建

　　以PMD18T VectormIL28为模板，经PCR扩增获得编码鼠IL28成熟蛋白的DNA序列，大小为520 bp，将扩增的序列插入pET30载体，构建重组表达载体pET30amIL28。挑取阳性克隆，经菌落PCR、经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和DNA序列测定，结果均与预期设想一致，表明该载体构建成功（图1）。

　　2.2 融合蛋白的诱导表达

　　工程菌经1 mmol/L IPTG在37℃诱导3 h后，进行SDSPAGE，发现与未诱导的对照菌相比，诱导菌在27 000左右处得到较纯的单一蛋白条带(图2)。纯化后多抗纯度可达90％ 以上。
　　
　　2.3 重组蛋白的纯化

　　在 37℃振荡培养条件下，诱导表达的IL28可溶形式融合蛋白经NiNTA亲和层析纯化后，获得了高纯度重组IL28融合蛋白。上柱前裂解液、上柱后裂解液进行SDSPAGE后，经凝胶图像分析系统分析显示，目的蛋白(IL28)具有极高纯度(图3)。

　　2.4 ELISA方法检测多克隆抗体效价

　　将多抗进行倍比稀释，用间接ELISA方法进行检测。多克隆抗体稀释倍数为10，100，1 000，10 000，100 000时，其D值分别为3.5，3.32，2.27，1.78，0.94。多克隆抗体的抗体效价达1∶1×105。

　　3 讨 论
　　
　　大肠埃希菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌， 它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉， 可以快速大规模地生产目的蛋白等优点［4］， 而且其表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统， 表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30 %， 因此大肠埃希菌目前在蛋白质表达中应用最广泛［5］。pET系统是在大肠埃希菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统，最初由Studier等［6］利用与启动子配套能高效转录特定基因的外源RNA 聚合酶构建的T7 RNA 聚合酶/启动子系统［7］， 可以从各种基因（包括原核、真核细胞）生产大量的目的蛋白。

　　本研究表达的重组mIL28蛋白主要以包涵体形式存在，容易通过离心收获包涵体，有利于分离纯化；包涵体能保护蛋白免受蛋白酶水解;目的蛋白以无活性的包涵体形式表达，不会影响宿主菌生长。该包涵体经变性溶解后进行分离纯化，其变性溶解产物通过Ni柱得到了进一步亲和纯化， 回收的目的产物SDSPAGE经凝胶图像分析系统分析显示，表现为27 ku条带（图3），表明用Ni 柱进行亲和层析具有高效、高容量、快速的特点。纯化后包涵体的复性过程主要包括肽链折叠和分子内二硫键的氧化，适当折叠的肽链常常有利于正确二硫键的形成。目前蛋白质复性通常有透析复性和稀释复性两种方法。本实验采用透析进行变性mIL28 的复性。实验结果表明，整个复性过程未见明显沉淀产生，表达产物由变性失活状态转变成具有活性的复性物。

　　利用纯化蛋白免疫实验用鸡，成功制备该蛋白的多克隆抗体，ELISA 检测抗体效价达1/100 000，发现该抗体具有高度特异性，本研究可制备大量纯化蛋白和多克隆抗体，为进一步探索IL28 的蛋白结构、生物学效应及其生物学作用机制提供了依据。

参考文献

　［1］Sheppard P， Kindsvogel W， Xu W，et al.IL28， IL29 and their class II cytokine receptor IL28R［J］.Nature Immunol， 2003，4(1): 63-68.

　　［2］Kotenko SV， Gallagher G， Baurin VV，et al.IFNlambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex［J］.Nature Immunol， 2003，4(1): 69-77.

　　［3］Bartlett NW， Buttigieg K， Kotenko SV， et al.Murine interferon lambdas(type III interferons) exhibit potent antiviral activity in vivo in a poxvirus infection model［J］.J Gen Virol，2005，86(Pt 6):1589-1596.

　　［4］Nuc P， Nuc K.Recombinant protein production in Escherichia coli［J］.Postepy Biochem，2006; 52(4): 448-456.

　　［5］Dong X， Tang B， Li J， et al.Expression and purification of intact and functional soybean(glycine max) seed ferritin complex in Escherichia coli［J］.J Microbiol Biotechnol， 2008，18(2): 299-307.

　　［6］Studier FW， Rosenberg AH， Dunn JJ， et al.Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes［J］.Methods Enzymol，1990，185:60-89.

　　［7］Kang Y， Son MS， Hoang TT.One step engineering of T7expression strains for protein production: increasing the hostrange of the T7expression system［J］.Protein Expr Purif， 2007，55(2):325-333.