【摘要】 目的 探讨玻璃化冻存法对胎儿卵巢组织形态和功能的保存效果。方法 采用改良EG5.5/30玻璃化液冻存胎儿卵巢皮质片，解冻后观察卵巢组织学变化，卵巢皮质片异种异位移植后，观察受体鼠动情周期恢复率、恢复时间、卵泡发育状况。结果 实验组与新鲜培养后移植组、添加抗氧化剂培养后移植组相比动情周期恢复率差异无统计学意义(P＞0.05)，但高于新鲜移植组(P＜0.005)；动情周期恢复需要的天数接近于新鲜移植组，明显短于两种培养组(P＜0.05)；在卵泡计数上，实验组每高倍视野的卵泡计数明显高于新鲜移植组(P＜0.005)，与培养后移植组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。移植后18周，组织学观察见大量窦卵泡，而培养组仅偶见窦卵泡。结论 玻璃化冻存法可有效冻存胎儿卵巢组织，且不影响卵泡继续发育的潜能。
【关键词】 胎儿卵巢组织 玻璃化冻存 异种异位移植
Abstract: Objective To investigate the effects of cryoprotective on morphology and function of fetal ovaries tissue by vitrification preservation. Methods Tetal ovarie's tissue was preserved in improved EG5.5/30 vitrification solutions. After being thawed fetal ovary tissue were examined histologically， and xenotransplantation were conducted to observe the ratio of recovery of oestrous cycle， the beginning days of recovery of oestrous cycle， follicles development， so as to evaluate the cryopretective effect of vitrification preservation. Results There were not significant differences among the vitrification transplanted group and the two cultured transplanted group in the recovery of oestrous cycle. But the recovery of oestrous cycle in vitrification transplanted group was higher than that in fresh transplanted group. The beginning days of recovery of oestrous cycle in vitrification transplanted group were shorter than those of the second and the third group. It came close to that of freshtransplanted group. in the number of follicles， vitrification transplanted group showed no significant differences with the two cultured transplanted group but a significant difference with the fresh transplanted group. After xenografting for 18 weeks， a amount of antral follicles were found in the vitrification transplanted group， but a few antral follicles were found in the two cultured transplanted group. Conclusion Vitrification can effectively preserve fetal ovaries tissue and doesn't affect the further development potential of follicles.
Key words: fetal ovaries tissue; vitrification; xenotransplantation
卵巢功能衰退可导致女性生殖内分泌功能减弱，引发机体一系列生理功能的紊乱，甚至导致严重的健康问题，这个问题已受到国内外生殖医学界学者的关注。人类卵巢组织冷冻保存移植技术具有巨大潜力，但患恶性肿瘤的患者有可能发生癌细胞转移，异体移植存在排斥反应，供体卵巢严重短缺等问题的存在使研究者们把目光投向了抗原性较弱、冷冻及移植后具备发育成熟潜能的胚胎卵巢。卵巢组织的保存主要采用传统的慢速冻存方法，但这种方法无法避免冰晶的形成，且冷冻所需设备昂贵，操作繁琐。玻璃化冷冻技术操作简单、冷冻效率高，目前多用于冻存胚胎和卵母细胞，为观察玻璃化冷冻技术用于胎儿卵巢组织的冻存效果，我们进行了本研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：用于卵巢移植的BALB/CA裸鼠30只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，8～12周龄，体重(25±1.8)g，处女鼠，作为卵巢组织异种异位移植用受体。
1.1.2 胎儿卵巢的获取：胎儿卵巢取自我区各大医院收治的因各种原因水囊引产的20～28周死亡女胎，征得家属同意后，于引产后2h内无菌取材，生理盐水冲洗数次后，于12倍实体显微镜下切除卵巢周围多余的脂肪组织、系膜及髓质，并将皮质切成2mm×2mm×1mm大小的皮质块待用。
1.1.3 实验用液体的配制：冷冻保护液(cryoprotectant，CPA)和解冻液均采用含10％小牛血清的DMEM和F12培养液作为基础液。所需液体在此基础上添加不同浓度的乙二醇(EG)、蔗糖、聚蔗糖及β-巯基乙醇(β-ME)。冷冻保护液：①预渗透平衡液为1.5M EG；②玻璃化液采用我室研制的EG5.5/30液。③解冻液分别为含0.5、0.25、0.125mol/L蔗糖的基础液配制。④培养液：A液 含10％小牛血清的DMEM和F12的基础培养液；B液 在A液的基础上添加100μM的β-ME。
1.2 方法
1.2.1 胎儿卵巢组织的冻融：冷冻管为0.5mL的国产塑料麦管，直径0.5cm，长8cm。
1)冷冻方法：①将要冻存的皮质块侵入1.5M EG预渗透平衡15min；②将预渗透平衡后的皮质块移入EG5.5/30玻璃化液继续渗透平衡5～6min；③在第二步渗透平衡过程中，将皮质块装入冷冻麦管内，每管8枚皮质块，全过程在22～24℃下进行；④麦管不封口，在卵巢接触玻璃化液的5～6min时将麦管投入-196℃的液氮罐中保存。
2)解冻方法：卵巢皮质块冻存1～7d后，将麦管从液氮中取出，室温下停留10s，置于37℃水浴中20s。剪开麦管一端，卵巢皮质块连同保护液一起流入盛有1mL、0.5M蔗糖解冻液的表面皿中，充分晃动，渗透平衡5min后，在0.25、0.125M含20％小牛血清的蔗糖液内依次洗脱5min，最后入PBS液充分洗涤，一部分入Bouin液进行固定，用于石蜡切片组织学分析，一部分入DMEM+F12培养液，置于CO2培养箱，30min后移植。
1.2.2 新鲜胎儿卵巢组织的培养方法：将新鲜胎儿卵巢皮质块随机放入加有2mL培养液A液或B液的培养瓶内，以棉塞封口，放入5％CO2培养箱内37℃培养3d后进行异种异位移植。
1.2.3 卵巢移植实验分组：
1)对照组：①新鲜移植组(fresh transplantation group，FTG组)，取出后即移植； ②新鲜培养后移植组(培养液为A液)(cultured and transplantation group，CTG组)；③添加抗氧化剂β-ME100新鲜培养后移植组(培养液为B液，cultured in β-ME100 and transplantation group，β-ME100CTG组)。
2)实验组：玻璃化冻存后移植组(vitrification preservation and transplantation group，VG)。
1.3 冷冻效果的判断
1.3.1 新鲜及解冻后卵巢组织切片观察：新鲜及解冻后的卵巢皮质块立即制作石蜡切片，经苏木精-伊红(HE)染色后观察卵泡、卵母细胞和颗粒细胞的结构。
1.3.2 异种异位移植：采用去势裸鼠双肾被膜下卵巢组织移植方法；移植后通过下列指标对移植物活力进行判断。
①动情周期恢复时间及恢复率观察：裸鼠移植术后第5天起每日清晨8：00行阴道细胞涂片检查，通过观察脱落细胞类型了解移植后的卵巢组织是否恢复内分泌功能，当涂片中有50％以上细胞为角化细胞并呈现规律性周期活动时视为动情周期恢复；记录动情周期恢复的时间和动情周期维持的情况。
②移植后组织学观察：分别在移植术后10、14、18周处死裸鼠，观察记录移植卵巢组织的形态、大小、血供情况。取材后制作石蜡切片，HE染色，光镜下观察移植存活卵巢内卵泡生长情况，在各移植组存活移植物连续切片中的卵泡最多切面处随机选5个高倍视野，计数每个视野内的卵泡数，并计算其平均值。
1.4 统计学方法
动情周期出现天数采用SPSS 11.5统计软件进行方差分析，计数资料行χ2检验，P＜0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 新鲜及解冻后卵巢组织形态
经玻璃化冻存法冻存并解冻后的胎儿卵巢组织卵泡形态学结构与其它各组相似，卵巢组织结构清晰，原始卵泡保存完整、结构保持较好。卵泡形态与新鲜胎儿卵巢相近(图1、2，见封3)。
2.2 动情周期恢复情况(表1)表1 胎儿卵巢组织解冻移植后裸鼠动情周期恢复情况（略）
实验组裸鼠动情周期恢复率与CTG组和β-ME100CTG组相比差异无统计学意义(P＞0.05)，但高于FTG组(P＜0.005)；动情周期开始时间实验组明显短于CTG组和β-ME100CTG组(P＜0.05)，与FTG组相比差异无统计学意义。
肉眼可见各移植组存活的移植物生长于肾被膜下。10周取材时，移植物体积明显增大约3mm×4mm×3mm，多数生长成圆形或椭圆形，移植物表面柔软，体视镜下可见血管生长。14周取材时，移植物与10周相比体积无明显变化，体视镜下可见血管走行。实验组裸鼠于18周取材，见移植物较其它组大，有明显的透明状窦状卵泡(图3，见封3)。
2.4 移植物组织学观察
2.4.1 一般组织学观察：新鲜胎儿卵巢组织可见大量的原始卵泡，靠近卵巢髓质区内可见有卵泡发育，卵泡细胞由单层扁平变为立方形；玻璃化冷冻解冻后，卵泡结构保持较好，卵泡形态与新鲜胎儿卵巢相近。移植受体取材时，可见存活移植物内毛细血管丰富，有不同发育阶段的各级卵泡，随着术后时间的延长，生长卵泡数目也随之增加，18周时可见移植物内有数个大的窦卵泡(图4，见封3)。
2.4.2 异种异位移植后移植物的存活情况(表2)：表2 胎儿卵巢组织解冻移植后各组移植物的存活情况（略）
按照Newton等研究者的方法［1］对卵泡进行统计。
3 讨论
目前，卵巢移植可解决卵巢缺如、卵巢早衰、卵巢发育不全患者的病痛，但新鲜卵巢移植存在着供体保存困难，缺乏为组织配型的时间、移植后免疫排斥反应较重等弊病，限制了卵巢移植在临床的开展。胚胎卵巢作为供体来源以其细胞有较强的分化能力、与其他组织细胞间建立功能联系的可塑性、抗低温、抗缺氧、易成活、易获得、不易引起免疫排斥反应的优点，有较好的应用前景。尽管胎儿卵巢抗原性较低，但依然存在抗原。近几年来研究者们在如何降低免疫排斥，提高卵巢移植后存活率等方面做了大量的研究。有报道表明，在移植前对卵巢组织进行体外培养及冷冻保存均可降低移植后的免疫排斥反应，有利于移植物的存活，改善培养条件提高冻存效果就成为提高卵巢移植效果的关键环节。已有研究者试图在移植卵巢血管重建前使用抗氧化处理来减轻组织的缺氧性损害。有报道显示，给移植受体补充VE可有效减少缺血-再灌注对同种移植卵巢皮质的损伤，提高卵泡存活率［2］。在我们的实验中，通过在体外培养液中添加抗氧化剂100μMβ-ME培养，不但有利于移植物存活，更有利于移植物内卵泡的存活和发育，异体异位移植率明显高于新鲜组，说明培养的确可提高移植后存活力，这可能与降低免疫原性有关［3］。但单纯采取培养的措施不能长期保存卵巢组织，且培养过程易致污染，不适合在临床上推广应用，因此摸索高效、简便的保存方法就成为研究的焦点。目前，对卵巢组织的低温保存常采用慢速程序冻存法、超速冻存法、玻璃化冻存法。而近年来玻璃化冷冻法在成功冻存多种动物的早期胚胎、卵细胞方面显示出了较程序控制降温法和超速法明显的活力优势［4］。玻璃化冷冻原理是细胞受高浓度CPA作用后，在极快的降温速度下细胞内外液无冰晶形成，呈现均质的玻璃态，基本上可避免细胞内冰晶形成导致的机械损伤。然而采用玻璃化冻存技术必须注意降低二方面的损伤：①高浓度保护剂对组织的化学毒性损伤，组织在高浓度CPA中的时间过长则产生的化学毒害作用就越大［5-6］；②渗透平衡和解冻时的渗透压剧变所造成的损伤。冷冻卵巢组织较冷冻胚胎或卵细胞更加复杂，因为卵巢中含有数目、大小、水含量及对水渗透性各不相同的多种细胞种类，而且存在血管系统，较之配子、胚胎的冻存具有更大的难度和挑战。已有采用玻璃化方法冻存1d小鼠和成年羊卵巢的报道，但玻璃化后的卵巢仅进行了体外培养原始卵泡发育［7］、卵泡活性、密度和结构的观察［8］。目前国内外鲜见玻璃化冷冻胎儿卵巢组织的报道。我室在防止高浓度保护剂的毒性损伤和渗透损伤的研究中，通过动物实验观察了新生大鼠卵巢器官在玻璃化液中的渗透反应，在冷冻过程中摸索了适宜的二步法渗透平衡时间［9］，采用这种方法我们对胎儿卵巢组织的玻璃化冻存后进行了异种移植的卵巢体内活性观察，研究中发现：经过玻璃化冷冻移植后动情周期恢复率达到75％，明显高于新鲜移植组33.3％，有极显著性统计学意义。而动情周期开始需要的天数与新鲜移植组接近，明显短于培养组，说明玻璃化冻融移植后动情周期恢复的快，恢复率高。在存活移植物及存活率上，各移植组间无统计学意义，在卵泡计数上，玻璃化冷冻组与各培养后移植组间无统计学意义，但与新鲜移植组相比，差异极显著。这也充分说明，在移植前对胎儿卵巢组织进行培养或冷冻，可降低移植后的免疫排斥反应，有利于移植物的存活。最为可喜的是，移植18周后的移植物大于培养后移植组，还出现了大量的窦卵泡。
综上所述，玻璃化冻存法无需添加抗氧化剂和可增加污染机会的体外培养，就可获得上乘的移植效果，操作极为简单、快速，冷冻只需20min就可完成，是一种值得推广的冷冻方法。
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