【摘要】 目的 研究环孢霉素A(CsA)在青光眼滤过手术中的抗增殖作用。方法 将20只中国白兔40只眼随机分成2组，一组为环孢霉素组，另一组为生理盐水对照组，2组均行小梁切除术，术中分别在结膜瓣下放置2％环孢霉素A、生理盐水棉片5min，在术后第1、7、14、30天观察眼压、滤过泡、角膜、眼底，并行光镜、电镜及增殖细胞核抗原(PCNA)检查。结果 环孢霉素A组眼压控制多较理想，与对照组间的差异有统计学意义(P＜0.05)，大多数形成功能性滤过泡，光镜下见极少量纤维组织增生，电镜下见纤维细胞线粒体少，染色质功能不活跃，增殖细胞阳性率低，与对照组差异有统计学意义(P＜0.05)，且没有浅前房、视网膜损害等严重并发症。结论 环孢霉素A在兔眼滤过手术中抗增殖作用好，安全性高。
【关键词】 环孢霉素A 滤过手术 眼 兔
Abstract: Objective To study the antiproliferative effects of cyclosporine A in filtering operation. Methods 20 Chinese white rabbits，40 eyes， randomly were devided into 2 groups， cyclosporine A group and normal sodium group， and underwent trabeculectomy. During the operation， 2％ CsA and NS were placed under conjuctival flap for 5 minutes， and then 100mL balanced salt solution was used to flush the area. At 1st， 7th，14th，and 30th day after surgery， filtering blebs， intraocular pressure， cornea and ocular fundus were observed.The operative area was examined with light microscope， electronic microscope， and the proliferating cell nuclear antigen(PCNA)was detected. Results In CsA group， intraocular pressure was significantly lower than that in NS group(P＜0.05)， and more functional filtering blebs were observed. Less fibroplasia and proliferative cells， less bioblast and less active caryotin in fibrocyte were found in CsA group than that in NS group. No serious mcomplicaton was found in both group. Conclusion CsA is safe and has a better antiproliferative effect in filtering operation.
Key words： cyclosporin A; filtering operation; eye; rabbit
青光眼滤过手术是治疗青光眼的主要手术方法，但由于术后纤维组织增生，常造成滤过通道阻塞，房水引流不畅，导致手术失败。环孢霉素A(cyclosporine A，CsA)是一种强效免疫抑制剂，广泛应用于器官移植及免疫相关性疾病的治疗。最近研究表明，CsA对多种细胞的生长有抑制作用，本研究将CsA用于青光眼滤过术中，旨在观察其抑制纤维组织增生的效果及安全性。
1 材料和方法
1.1 实验动物和分组
选用健康中国白兔20只(宁夏医学院实验动物中心提供)，体重2.5～3.0kg，月龄5～6个月，雌雄兼有，无眼病。随机分成两组，CsA组和生理盐水对照组，每组20只眼。
1.2 主要材料
山地明注射液(环孢霉素A)，Novartis Pharma AG Switzerland生产；丝裂霉素C，浙江海正药业股份有限公司生产；小鼠单克隆抗增殖细胞核抗原、生物素化山羊抗小鼠IgG抗体、链霉素-生物素D-过氧化物酶复合物(SABC复合物)、二氨基联苯胺(DAB)均为武汉博士德生物有限公司生产。日产HITACHI H-600 透射电镜。
1.3 方法
用3％戊巴比妥钠，按1mL/kg耳缘静脉注射麻醉，术前10min双眼各滴0.4％盐酸奥布卡因表面麻醉3次。以角巩缘为基底做8mm×6mm结膜瓣，双眼分别用浸2％CsA、生理盐水的海绵片(4mm×3mm×2mm)置于巩膜面上5min，用20mL生理盐水冲洗，制作4mm×4mm板层巩膜瓣，切除1mm×3mm小梁组织，根切虹膜，10-0尼龙线缝合巩膜瓣2针，分层缝合Tenons囊和球结膜瓣致密闭。术后双眼滴用0.1％滴塞米松眼液、0.25％氯霉素眼液，每天4次，共1周。术后每天观察滤过泡、结膜、角膜、前房情况，术后1周、2周、1个月测眼压、观察眼底，在术后1周、2周、1个月分别用空气栓塞法处死动物5、5、10只，立刻取滤过泡及其附近组织，一分为二，一半用10％中性甲醛固定，石蜡包埋，制作病理切片，分别予HE染色、增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)染色，并行光镜检测；另一半用2.5％的戊二醛固定，行电镜观察。
1.4 统计学方法
采用SPSS 10.0统计软件，应用卡方检验、t检验和秩和检验对实验数据进行统计学处理。
2 结果
2.1 各组白兔术前、术后眼压(表1) 表1 实验组与对照组眼压比较(略)
经t检验，各组白兔术前、术后第1天眼压差异无统计学意义(P＞0.05)；术后第7、14、30天CsA组眼压较对照组下降明显，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
2.2 各组白兔术后滤过泡形态(表2) 表2 实验组与对照组滤过泡形态比较（略）
滤过泡依照Krofeld分型法分为4型：Ⅰ型微小囊泡型、Ⅱ型扁平弥散型、Ⅲ型瘢痕型、Ⅳ型包囊型。Ⅰ、Ⅱ型为功能滤过泡，Ⅲ、Ⅳ型为非功能滤过泡；虽然经χ2检验两组间差异无统计学意义(P＞0.05)，但是实验组在各个时期功能性滤过泡比例明显增高，且泡壁薄，血管少。
术后1周生理盐水组见较多淋巴细胞、单核细胞、浆细胞浸润，大量新生毛细血管；CsA组炎性细胞和毛细血管均较少。术后2周，生理盐水组炎症细胞和毛细血管渐减少，出现成纤维细胞和少量增生纤维组织；CsA组炎性细胞更少，偶见成纤维细胞。术后第30天，生理盐水组见大量致密纤维组织，CsA组仅见少量稀疏纤维组织。
2.4 术后不同时期滤过区组织电镜检查结果
生理盐水组术后7d，见多量圆形核细胞，胞质空化，内质网肿胀，少量成纤维细胞；术后14d，见多量成纤维细胞，胞核增大，核仁染色深，核膜突起多，内质网肿胀明显，胞浆受压，质少，间质内胶原量多，紊乱；术后30d，见大量成纤维细胞，核染色变浅，核膜突起减少，内质网肿胀减轻，胞浆增多，空化少，间质纤维致密。CsA组：术后7d见少量炎性细胞，细胞浆内空泡，内质网肿胀；术后14d，少量成纤维细胞，核仁染色略深，核膜突起少，内质网轻度肿胀；术后30d，成纤维细胞略增多，核仁规则，间质少量胶原纤维，排列整齐(图2～4，见封4)。
2.5 成纤维细胞PCNA检测结果 (图5、6，见封4)
PCNA阳性结果为细胞核界限清楚呈棕黄染色的成纤维细胞。正常结膜下、巩膜上组织无纤维组织增生，滤过术后，PCNA阳性细胞明显增加，各组分别在结膜下、巩膜上部位随机选取5个高倍镜视野，计算PCNA阳性细胞的数目。术后第7天，两组间均偶见增生的PCNA阳性细胞，无明显差异；术后第14、30天，CsA组PCNA阳性细胞数少，经秩和检验，两组差异明显(P＜0.05)。三个时间点秩和检验结果分别为U=6.500，P=0.166;U=11.000，P=0.003；U=1.000，P=0.016。
2.6 并发症
CsA组有3例出现角膜上皮点状剥脱，自行愈合，未见浅前房及视网膜损害；生理盐水组有1例上皮点状损害，自愈。
3 讨论
小梁切除术是治疗青光眼的主要手术方法，术后滤过口开放、滤过道通畅，是房水外流、手术成功的保证［1］。但由于手术后成纤维细胞的增殖和移行，阻塞滤过通道，常造成手术失败。PCNA，又称周期素，是一种仅在增殖周期中合成和表达的核内多肽链，可以作为评价细胞增殖状态的指标之一。CsA是一种新型免疫抑制剂，广泛用于器官移植及免疫有关的疾病，近年来研究发现CsA还具有抗增殖作用，在适当浓度能有效抑制血管内皮细胞、成纤维细胞、表皮角质细胞、结膜成纤维细胞、晶状体上皮细胞的增殖［2-3］。关于CsA抗增殖作用的确切机制尚未完全阐明，可能通过以下途径作用于瘢痕形成的各个环节［4］：通过与其受体(CPH)结合，通过靶物质与相应的转录基因控制蛋白发挥抗增殖作用；通过抗炎、抑制细胞表达白细胞介素、肿瘤坏死因子、碱性成纤维细胞生长因子的产生来抑制成纤维细胞的活化；通过抑制血管形成或使血管产生痉挛造成局部缺血；抑制细胞分泌胶原；诱导成纤维细胞凋亡；通过抑制免疫反应抑制成纤维细胞持续产生瘢痕组织［5］；在肉芽组织早期抑制金属蛋白酶2，9活性而抑制伤口愈合［6］。关于CsA在眼部应用的安全性，已有很多报道：CsA是亲脂性化合物，滴眼剂能迅速透过角膜上皮，但眼内通透性差［7］，房水中浓度很低［8］，所以对角膜内皮作用不大，不易引起角膜内皮毒性，造成角膜水肿、混浊及视网膜损伤。Akyol等研究发现［9］，CsA对睫状上皮的改变轻微。本实验通过在术中一次性使用2％CsA，能有效抑制纤维组织增生，减少瘢痕形成，保持滤过道通畅，形成功能性滤过泡，使手术获得成功。而且在术中一次性、短时间用药，再加用生理盐水彻底冲洗，故局部并发症很少，仅3眼有角膜上皮点状缺损，并自行消退，未见滤过泡漏、角膜混浊、低眼压、晶状体混浊及视网膜损伤等严重并发症。因此我们认为：CsA能有效抑制成纤维细胞的增殖，保证滤过道通畅，合理控制眼压，且比较安全，是较理想的辅助抗青光眼的药物。
参考文献
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