脑梗死患者纤维蛋白原β455G/A基因多态性的研究

　　　　　　 作者：周秀春，王义刚，陈才进

【摘要】 目的 探讨血浆纤维蛋白原(Fg)水平、β纤维蛋白原基因(Fg β)455 G/A多态性与脑梗死的关系。方法 用PCRRFLP(多聚酶链限制性片段长度多态性) 和比浊法分别检测220例脑梗死患者和140例健康体检者血浆Fgβ455G/A基因多态性、Fg水平，并分析其与脑梗死的关系。结果 脑梗死组的Fg水平[(3.8±0.9) g/L]明显高于对照组[ (3.0±0.8) g/L](P&<0.01)，脑梗死组A455等位基因频率(30.2%)明显高于对照组(17.1%)(P&<0.01)。结论 Fg水平受Fgβ455G/A基因多态性的影响，水平升高是脑梗死的危险因素。

【关键词】 脑梗死;纤维蛋白原;基因多态性

　　Abstract: Objective To study the relationship between plasma fibrinogen (Fg) level and βfibrinogen (Fg β) gene 455A/G polymorphism and cerebral infarction (CI). Methods Plasma Fg β gene 455A/G polymorphism and Fg level in 220 patients with cerebral infarction and 140 healthy controls were determined by PCRRFLP and turbidimetry， respectively， and the relationship between them was analyzed. Results Plasma Fg level and Fg β455 A allele frequency were significantly higher in CI group than those in control group [(3.8±0.9)g/L vs (3.0±0.8)g/L， P&<0.01; 30.2% vs 17.1%， P&<0.01]. Conclusion Fg β gene 455A/G polymorphism can influence Fg content. Fg overexpression might be a risk factor for cerebral infarction.

　　Key words: cerebral infarction; fibrinogen; gene polymorphism

　　随着我国老龄化社会的到来，脑梗死的发病率呈逐年上升的趋势。目前研究多认为血浆纤维蛋白原基因的多态性，尤其是其启动因子区域的β455G/A基因多态性与血浆纤维蛋白原水平密切相关。本文旨在观察Fgβ455G/A基因多态性对缺血性脑梗死疾病的发病的影响，探讨纤维蛋白原升高与缺血性脑梗死发病的可能机制，为缺血性脑梗死疾病易感人群的检测和早期防治提供的依据。

　　1 资料和方法

　　1.1 研究对象

　　2004年10月至2005年12月在我院住院的首次发病脑梗死患者220例作为脑梗死组，其中男130例，女90例;年龄37～75岁，平均年龄(63.2±1.0)岁;发病7 d内;祖籍广东湛江，均为汉族人;符合全国第四届脑血管疾病会议修订的诊断标准;并经头颅CT/MRI证实;病前未用过影响纤溶和凝血的药物，且已排除各种感染及感染性疾病，严重肝、肾及免疫性疾病，肿瘤，血液病患者，3个月内无发热、脑血管意外、创伤及外科手术史。以同期我院门诊健康体检者140例作为对照组，其中男92例，女48例;年龄40～75岁，平均(61.6±9.8)岁，祖籍广东湛江，均为汉族人，无心、脑、肝、甲状腺疾病病史，无糖尿病病史，近期无炎症。脑梗死组及对照组间的年龄、性别构成差异均无统计学意义(P&>0.05)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 血标本采集 脑梗死组患者于发病7d内抽取血样，对照组的体检者则为体检时抽取血样。所有观察对象均为早晨空腹采血，抽取肘部静脉血2.0 mL，至5mL离心管中(每管中先加入3.8%枸橼酸钠1:9抗凝)。室温下3000 r/min离心10 min，上层血浆贮存于-80℃备用，用于测定Fg水平。沉淀部分用于DNA制备。

　　1.2.2 血浆纤维蛋白原含量测定 用比浊法测定：(1) 将待测血浆用生理盐水作10倍稀释(0.1 mL血浆+0.9 mL生理盐水);(2) 8 μL稀释血浆加300 μL抗血清，混匀300 s后测定;Fbg含量(g/L)=(测定管A值/参比管A值)× 参比品质量浓度(g/L)。

　　1.2.3 DNA制备 按照Lahir等[1]的方法进行。

　　1.2.4 Fgβ455G/A基因型分析 引物序列

参考文献

[2]进行，通过PCR Design软件设计引物，上游引物5'ATAG AATAGGGTATGAATTTG 3'，下游引物5'GGCTGAACCA TTTTATCATT T3'。PCR 反应体系为25 μL。终浓度为1×buffer， 2 mmol/L MgCl2， 200 μmol/L dNTP， 引物浓度各0.4 μmol/L ，待测DNA 5 μL。25μL反应液中含TaqDNA聚合酶0.6 U。94℃预变性5 min后，94℃55 s，54℃退火50 s，72℃延伸60 s，35个循环后再于72℃延伸5 min。取β455G/A位点的PCR产物15 μL，加限制性内切酶HaeⅢ5U及相应酶切缓冲液，总体积20 μL，37℃水浴2 h。取β455 G/A PCR酶切产物10 μL，在2%琼脂糖凝胶(己经加入溴化乙锭)上进行电泳，电压100V，电泳后在紫外灯照射下观察并用UVP凝胶成像系统摄片，根据电泳图谱确定基因类型。

　　1.3 统计学处理

　　应用SAS8.0 统计软件包，多态性基因频率群体分布用Hardy Weinberg平衡检验，基因型频率及等位基因频率的比较用χ2检验，计量资料采用t检验。以P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 Fgβ455 G/A基因多态性分布及基因频率

　　Fgβ455 G/A位点脑梗死组A等位基因频率为30.2%，对照组为17.1%，两组比较差异有统计学意义(P&<0.01)。详见表1。表1 两组Fgβ455 G/A基因多态性及等位基因频率　的比较 与对照组比较：* P&<0.01。

　　2.2 Fg β455 G/A基因多态性与血浆Fg质量浓度的关系

　　本文从脑梗死组和对照组中各抽取100例，检测他们的血浆Fg质量浓度，脑梗死组的血浆Fg水平显著高于对照组[(3.8±0.9)g/L vs (3.0±0.8)g/L，P&<0.01]。详见表2。

　　3 讨论

　　Fg即凝血因子Ⅰ，是一种主要由肝细胞合成分泌表2 两组Fg β148 C/T基因多态性血浆Fg质量浓度的比较的血浆球蛋白，为血浆中含量最丰富的蛋白质之一，分子量为340KD，由Aα、Bβ和γ链3条多肽链通过二硫键相连接构成对称二聚体。目前研究表明，Fg基因中至少存在20多个多态性位点，其中在β链有β148 C/T、β249C/T、β455G/A、β854G/A、β933C/T、β1420G/A、β+345C/T、β+448G/A、β+1689T/G、BcⅡG/A、I6(I/D)、HindⅠ、Bβ内含子2、Bβ密码子159等。β455G/A基因多态性的分布频率在各个国家、民族甚至同一个国家的不同地区间亦不一致。芬兰、英国、欧洲北、中、南部地区β455G/A等位基因频率为分别为0.205、0.204、0.229、0.221、0.213，丹麦哥本哈根为0.203，瑞典为0.25。本文发现中国湛江地区汉族健康人群β455G/A等位基因频率0.171，低于上述国家和地区。说明Fgβ455G/A多态频率具有种族和地域差异性。

　　纤维蛋白通过血小板膜糖蛋白(GP) IIb/IIIa复合体结合到血小板上，介导血小板聚集反应，介导血液流变学变化，促进动脉粥样硬化斑块形成和血管狭窄。所以，纤维蛋白原与血管壁、血栓形成、动脉硬化间存在某种相互作用关系。本文发现，脑梗死组血浆Fg水平[(3.81±0.99) g/L]明显高于对照组[(3.0±0.76) g/L]。这与报道Fg与脑梗死相关的一些研究结果一致[3-5]。因此提示，高Fg水平是急性脑梗死的危险因素。

　　脑梗死是一个综合征，而并非是一个独立疾病，其发病机制复杂，存在异质性。目前关于βFg455G/A基因多态性与脑梗死关系的报道较多，但结论不一致[6]。我们通过PCRRFLP方法，分析Fg 455G/A基因型频率和等位基因频率在对照组和脑梗死组的分布，Fgβ455 G/A位点脑梗死组A等位基因频率为30.2%，对照组为17.1%，两组比较差异有统计学意义(P&<0.01)，脑梗死组A等位基因频率明显高于对照组，由此可见，对于中国雷州半岛地区汉族人，β455 A等位基因携带者比非携带者患脑梗死的危险性大。如前所述，β455A等位基因与血浆Fg水平表达有关，故其危险作用可能是通过Fg来实现的，也就是说Fg可能是连接基因突变这个遗传因素与脑梗死发病这个表型之间的桥梁。

参考文献

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　　[2]TybjaergHansen A， AgerholmLarsen B， Humphries S E， et al.A common mutation (G455&> A) in the betafibrinogen promoter is an independent predictor of plasma fibrinogen， but not of ischemic heart disease. A study of 9，127 inpiduals based on the Copenhagen City Heart Study[J].J Clin Invest， 1997， 99(12): 30343039.

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　　[6]钱进军，刘春风，赵康仁. 脑梗死患者β纤维蛋白原455G/A、148C/T基因多态性和血浆纤维蛋白原水平研究[J]. 中风与神经疾病杂志，2004，21(2)：147149.