【摘要】 目的 观察骨髓基质细胞(MSCs)在大鼠纹状体出血模型脑内的存活及迁移特点，探讨其移植于出血脑内的可能性及适宜条件。方法 用密度梯度离心法分离培养成年SD大鼠的MSCs，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD11b、CD45和CD90以确定其纯度，细胞大量扩增后用逆转录病毒载体转染增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因。胶原酶加肝素纹状体注射法制备大鼠脑出血模型，行为学检测成功后，将细胞悬液5μL立体定位植入脑出血模型大鼠出血灶周边。不同时间分批灌杀大鼠，取脑作冰冻切片，免疫组织化学法检测移植细胞的EGFP表达。结果 流式细胞仪检测发现CD90+/CD45-/CD11b-细胞达到75%。细胞在体外能够稳定地表达EGFP。MSCs在脑出血灶周边至少可存活4周，这些细胞形态多样，主要分布于出血灶周边，并向周围脑实质迁移，大多数细胞定居于血管周围。结论 分离培养的MSCs纯度高，增殖能力强，可高效表达EGFP，移植到脑出血灶周边可存活并向周围迁移。
【关键词】 脑出血 纹状体 骨髓基质细胞 移植 存活 大鼠
Abstract： Objective To explore the surviving and migration of Bone Marrow Stromal Cells(MSCs) in brain of the striatal hemorrhage model of rat， and to investigate the possibility and appropriate condition of transplanting MSCs into brain of the striatal hemorrhage model. Methods MSCs was collected from adult SpragueDawley(SD) rats by density gradient centrifugation method. Cell surface antigen CD11b， CD45 and CD90 were measured in order to estimate the purity of MSCs. After being expanded， transduction of MSCs with a retroviral vector containing the enhanced green fluorescent protein (EGFP) cDNA was performed. The striatal hemorrhage animal model was established by injecting collagenase and heparin into the striatum. After praxiology test succeeded， 5μl MSCs suspension was stereotactically transplanted into the brain of striatal hemorrhage model. Then rats were killed in batches at different time， and brain sections were prepared with a cryostat. Here， we examined the surviving and migration of MSCs in the area around hemorrhage focus by examining EGFP expression of transplanted cells by immunohistochemical methods. Results Cell surface antigen test showed that CD90+/CD45－/CD11b－ cells added up to 75%. MSCs expressed EGFP steadily in vitro， and survived for 4 weeks after being injected in the area around hemorrhage focus of the striatal hemorrhage model. In the hemorrhage focus， a few surviving MSCs had a multiple morphological appearance， migrated into the area around the hemorrhage focus， and most of them resided around the vessels. Conclusion The results suggested that the cultured MSCs had a high purity， strong ability to proliferate， and great capability of longterm expression of EGFP. After being transplanted into rat brain， MSCs could survive and migrate in area around the hemorrhage focus. Further study is necessary to confirm whether MSCs can effectively repair the damage caused by intracerebral hemorrhage.
Key words：intracerebral hemorrhage；striatum；bone marrow stromal cells；transplantation；surviving；rat
随着干细胞研究的深入，替代疗法已成为脑损伤修复的新希望。骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，MSCs)是源于骨髓的一种多能干细胞［1］，在特定条件下，可跨胚层分化为神经胶质细胞和神经元［2］。由于其具有来源丰富、采集方便、扩增迅速、可行自体移植等诸多优点，已被广泛用于帕金森病(PD)、脑创伤、脑梗死等多种疾病的细胞和基因治疗研究［3-5］，而在脑出血方面至今尚未见报道。本研究将标记的大鼠MSCs立体定位植入大鼠纹状体出血模型脑内，运用免疫组织化学法观察其在脑内的存活及迁移特点，探讨MSCs移植于出血脑内的可能性及适宜条件。
1 材料与方法
1.1 材料
动物：成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌性，由首都医科大学动物科学部提供。试剂：α-MEM培养基、DMEM/HG培养基、胎牛血清(FCS)、胰蛋白酶(Trypsin)、二甲基亚砜(DMSO)、G418均为Gibco公司制品；淋巴细胞分离液为上海生化试剂厂制品；注射用青霉素、链霉素，乙二胺四乙酸，Polybrene为Sigma公司制品；CD45＼CD11b＼CD90荧光抗体为BD Pharmingen公司制品；含增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因的逆转录病毒(retrovirus，RV)上清由首都医科大学北京神经科学研究所细胞室提供；Ⅶ型胶原酶、肝素钠(12500u/2mL)为Sigma公司产品；免疫组化试剂盒购自北京中山生物制剂有限公司。
1.2 MSCs的分离、培养、鉴定和转基因标记
用密度梯度离心法分离培养成年雌性SD大鼠(200～230g，SPF级)的MSCs，流式细胞仪检测细胞表面抗原CD11b、CD45和CD90以确定其纯度，细胞大量扩增后用逆转录病毒载体转染增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)标记基因［6］。
1.3 大鼠纹状体出血模型的制备
取成年雌性SD大鼠(230～270g，清洁级)，参照任泽光［7］等的方法，在脑立体定位仪上定位前囟前0.4mm，中线右侧旁开3.0mm，深度5.0mm，注射1.0μg/μLⅦ型胶原酶0.5μL，肝素钠1.0μL(7U)制作大鼠纹状体出血模型。模型制备24h后，根据Bederson评分标准［7］选取得分在4分以上的大鼠用于后续实验。
1.4 动物分组与MSCs脑内移植
1.4.1 分组：将SD大鼠随机分为模型大鼠细胞移植组(移植组)和模型大鼠病理对照组(对照组)；移植组又分为细胞移植后12、24、72h和1、2、4周组，每组6只；对照组为模型制备24h后大鼠3只。
1.4.2 MSCs脑内移植：取表达EGFP的MSCs(第3～6代)，制成单细胞悬液，细胞浓度为1×104个/μL。在脑立体定位仪上定位前囟前0.4mm，中线右侧旁开3.0mm，深度为6.5mm，微量进样器吸取5.0μL细胞悬液(细胞总量：5×104个)，缓慢匀速地将细胞注入脑内。
1.5 EGFP免疫组化染色
各组大鼠按时间点常规心内灌注后取脑，切取注射点前后约5.0mm的脑组织作连续冰冻冠状切片，片厚20μm，隔4取1贴片，进行免疫组化(SP法)检测：0.01M PBST(pH 7.4)浸泡切片，3% h3O2清除内源性过氧化物酶，PBST浸洗，1N HCl修复抗原，PBST浸洗，5%山羊血清封闭非特异性抗原，加小鼠EGFP单克隆抗体(1∶1000，4°C，48h)，PBS浸洗，加入生物素化山羊抗小鼠IgM(1∶300，37°C，3h)，PBS浸洗，加入HRP标记的链霉卵白素(1∶300，37°C，3h)，PBS浸洗，DAB显色，蒸馏水冲洗，梯度酒精上行脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
2 结果
2.1 MSCs的纯度
利用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原，结果发现，CD90阳性细胞达到95.17%；CD45阳性细胞为7.76%；CD11b阳性细胞为7.37%；将三种细胞表面抗原组合检测发现，CD90+/CD45-/CD11b-细胞数约为75%。
2.2 EGFP的表达率
流式细胞仪检测表明，转染EGFP的MSCs常规传代后，EGFP的表达率达55.16%。
2.3 大鼠纹状体出血模型制备情况
制作大鼠纹状体出血模型50只，其中有2只大鼠因脑内出血过多分别在术后6、14h死亡。其余大鼠均出现程度不等的行为学改变，具体表现为：(1)将大鼠尾巴提起，左侧(瘫痪侧)前肢回收屈曲于腹下，右侧前肢向地面伸展；(2)大鼠左侧偏瘫，向左侧推大鼠时阻力较从对侧明显降低；(3)大鼠有向左侧旋转的行为。另外，大鼠还表现出进食少、萎靡不振、运动明显减少等症状。其行为学改变在术后2h即出现，术后4h～48h最为典型，大多数模型的行为学改变可持续4～6d，最长的可持续10d。
按Bederson评分标准［8］进行评分，得分在8分以上的大鼠有17只，4～8分的有31只。所有存活大鼠均达到成模标准(4分以上)，可用于后续实验。
2.4 模型大鼠脑组织大体形态观察
取模型制备6、12、24h后的大鼠各1只作脑组织大体形态观察发现，脑组织表面有一明显的注射损伤区，药物注射6h后可见直径约3.0mm的片状出血区，周围有明显的水肿带(图1，见封3)，12、24h后的出血区大小与6h时保持一致，基本不再扩大。
2.5 MSCs在大鼠纹状体出血模型脑内的存活及迁移
将EGFP标记的MSCs立体定位植入大鼠脑出血灶周边，不同时间灌杀大鼠，取脑作冷冻切片，免疫组织化学法检测发现，在12、24h组大鼠出血灶周边有大量EGFP免疫阳性细胞(图2、3，见封3)；在72h组大鼠出血灶周边也有EGFP免疫阳性细胞，但数量明显减少；在1、2周组大鼠出血灶周边没有发现明显的阳性细胞；而在4周组大鼠出血灶下端发现EGFP免疫反应呈阳性，高倍镜下可见数个梭形细胞(图4，见封3)。存活细胞散在分布于原定位注射部位，并向周围脑实质迁移，细胞大多围绕在血管周围，形态与体外培养时类似，有梭形、三角形、星形、圆形、圆锥形等。
3 讨论
脑出血后，出血灶中心区的神经细胞死亡而导致的神经功能缺损，至今尚缺乏真正有效的治疗措施和药物［9］。拯救损伤灶周边濒死的神经细胞目前有多种措施，细胞治疗被认为是可能有潜在应用价值的手段之一。研究表明，局灶性脑损伤后，损伤局部行细胞移植治疗是完全可行的，可作为治疗中枢神经系统疾病的一种手段，细胞移植已在帕金森病的治疗中取得了临床效果，并开始用于治疗遗传性舞蹈病和多发性硬化症［10］。
为探索MSCs在纹状体出血脑内的命运，为MSCs用于脑出血损伤的修复提供理论和实验依据，我们将EGFP标记的MSCs植入模型大鼠脑出血灶周边，不同时间处杀大鼠后观察发现，在12、24h组大鼠脑内移植部位有大量细胞存活，多数细胞定位于血管周围，而在1、2周组大鼠脑内移植部位无明显移植细胞，推测细胞在脑内不能长期存活的原因可能是没得到充足营养供应。4周组大鼠出血灶下端有少量细胞存活，提示保证充足的血液供应是MSCs在脑内存活的首要条件。
在细胞移植治疗中，细胞量是需要考虑的一个因素，尤其是MSCs，它对脑损伤的修复主要是其在脑内特殊微环境下诱导反应性分泌大量生长因子，促进血管及神经再生来发挥其神经保护作用［11］。Mahmood等［12］将1×106和2×106hMSCs经尾静脉分别注入TBI模型大鼠体内，结果发现，2×106细胞移植组大鼠的运动功能明显恢复，而1×106组则不明显。Chen等［5］也得到了同样的实验结果，他们将1×106和3×106MSCs经尾静脉分别注入MCAO模型大鼠体内，结果只有3×106细胞移植组大鼠的运动功能明显改善，表明应用MSCs移植治疗一定的细胞量是必需的。我们的研究着眼于MSCs在出血脑内的存活及迁移，因此只植入了较少的细胞(5×104个)以便于对结果的观察。
MSCs可经多种途径进行移植，经静脉途径移植的报道较多，这种方法操作简单、方便，对受体动物的损伤小，但进入脑内的细胞数较少，而且细胞也同时进入了其它脏器，虽然有作者报道［13］说并未在形态上发现有什么不良影响，但远期作用如何尚不得而知。我们在立体定位下将MSCs直接注入脑内，虽然对脑组织造成一定的损伤，但一次性注入的细胞量可以很大，而且在临床应用中，脑出血后在外科手术清除血肿的同时可以结合病人的影像学资料确定适合的靶点，将细胞定位植入脑内特定部位达到个体化治疗的目的。
脑出血后的病理形态变化过程大致分为三个时期：出血后3d内为血肿周围脑组织的缺血、水肿及坏死期；第4天进入血肿吸收期；第8天后血肿明显减小，继而进入瘢痕及囊肿形成期［14］。如果要保证大量的细胞在脑内存活，细胞移植时应该避过缺血、水肿、坏死期，但这样也就错过了尽早挽救濒临死亡细胞的最佳时机，而在早期植入细胞，出血灶内恶劣的环境又会导致细胞的大量死亡，这似乎是一个矛盾。有人研究［15］发现，将胚胎脑组织立即植入TBI大鼠模型脑损伤区，80%以上的移植物由于缺血缺氧而死亡，仅有极少量的移植细胞存活；而在24h后进行移植，约有68.8%的移植物可以存活；在损伤10～14d后进行移植，则有80%的移植物存活，表明移植时间对移植物存活有很大的影响。本研究将MSCs在脑出血24h后植入出血灶周边，细胞仅存活了72h，而能进入脑实质内的细胞则可以存活至4周。表明尽早地植入细胞并使其更多地成活，选择合适的移植部位及改善细胞所在的微环境非常重要，这有待于进一步的研究。
中枢神经系统的可塑性和功能重建是一个复杂的过程。研究表明，MSCs在脑内不仅可以分泌BDNF、bFGF、NGF、VEGF、HGF等多种生长因子［5］，还可以合成胶原蛋白、纤维连接蛋白、层粘蛋白等细胞外基质［16］。这些神经营养和保护因子可能通过不同的机制在损伤脑组织中发挥其神经保护作用。近来已经有研究发现，成年MSCs植入脑内后可以分化为有功能的神经元［17］。MSCs植入脑内后，也可以分化为表达神经元标记物的细胞，但这些细胞是否参与宿主的神经功能重建至今尚未见报道。已有的研究认为［18］，在应用MSCs治疗PD、TBI、脑梗死等神经系统疾病中，各种神经营养和保护因子的作用可能远比MSCs分化为有神经元标志的细胞占有更重要的地位。
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