重组线虫抗凝蛋白rAcaNAP9抗大鼠血栓的效果观察

　　　　 作者：康涛，刘东，刘运宝，殷环，练有文，刘文，彭礼飞

【摘要】 目的 观察重组线虫抗凝蛋白rAcaNAP9抗大鼠颈总动脉血栓的效果。方法 将40只SD大鼠随机分为rAcaNAP9低剂量组(40 μg/kg)、 中剂量组(200 μg/kg)、 高剂量组(1 mg/kg)、阳性药对照组(肝素钠，1650 U/kg)和模型对照组共5组，每组8只。分离大鼠一侧颈总动脉，从鼠尾静脉给药后，即用血栓生成仪对动脉进行恒流电刺激5min，检测受刺激血管的堵塞程度。结果 模型对照组的血管堵塞程度和rAcaNAP9低、中、高3个剂量组比较差异均有统计学意义(P&<0.05或0.01)。结论 重组线虫抗凝蛋白rAcaNAP9具有抗大鼠颈总动脉血栓效果。

【关键词】 重组线虫抗凝蛋白;rAcaNAP9;抗血栓;大鼠

　　Abstract: Objective To investigate the antithrombotic role of recombinant nematode anticoagulant protein rAcaNAP9 in rat's common carotid artery (CCA). Methods Forty rats were randomly pided into model control group， positive drug group (heparin， 1650 U/kg)， and low (40 μg/kg)， middle (200 μg/kg) and highdose (1 mg/kg) rAcaNAP9 groups. After isolation of unilateral CCA and intravenous injection of various drugs through caudal vein， the CCA was stimulated by a constant current for 5 minutes and its blood flow volume was recorded. Results The blood flow volume in 3 rAcaNAP9 groups was superior to that in model control group (P&<0.01 or 0.05). Conclusion The rAcaNAP9 has the antithrombotic effect on rat's CCA.

　　Key words:recombinant nematode anticoagulant protein; rAcaNAP9; antithrombosis; rat

　　线虫抗凝蛋白亦称线虫抗凝肽 (nematode anticoagulant protein/peptide， NAP)是近年来从钩虫体内分离得到的具有显著抗凝血活性的一类多肽(由约80个左右氨基酸组成)，可能开发为抗凝抗栓新药[1]。其中，重组线虫抗凝血蛋白c2(NAPc2)作为一种抗凝抗栓新药已进入Ⅱ期临床试验，它具有高效、半衰期长、副作用小等优点[12]。线虫抗凝蛋白AcaNAP9是作者课题组从犬钩虫中分离得到的一种具有显著的抗凝抗栓作用的多肽，其氨基酸序列与rNAPc2有65%的相似性[3]。本文对重组rAcaNAP9抗大鼠颈总动脉血栓效果作了观察，现将结果报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 药品与试剂

　　重组线虫抗凝肽rAcaNAP9由广东医学院寄生虫学教研室重组制备(重组蛋白抗凝活性：100nmol/L重组多肽延长约5倍PT时间);肝素钠注射液(上海第一生化药业有限公司，国药准字H31022051，批号：091104);水合氯醛(分析纯AR，中国医药集团上海化学试剂公司，批号：W20071204);氯化钠注射液(0.9%，国药准字h30043472，广东利泰药业有限公司，批号：09060623)。

　　1.2 仪器与器材

　　YLS14B小动物血栓生成仪(济南益延科技发展有限公司);ES2100电子天平(长沙湘平科技发展有限公司);常用外科手术器械。

　　1.3 实验动物与方法

　　SD大鼠，平均体质量(350±30)g(由广东医学院实验动物中心提供，合格证号：2008A036)。

　　SD大鼠40只随机分为5组，每组8只，即对照组(模型)、对照组(阳性药)和rAcaNAP9低、中、高剂量组。阳性药选用肝素钠注射液(给药剂量为1650 U/kg[4])，rAcaNAP9低、中、高剂量组(5倍递增)的给药剂量分别为40、200 μg/kg、1 mg/kg。全部由静脉注射给药。手术前所有大鼠禁食12h，按10%水合氯醛(450 mg/kg)进行腹腔麻醉后，仰卧位固定于手术台上，行颈前切口，分离一侧1.5～2.0 cm颈总动脉，用5号缝合线将其与附近组织隔开，并用生理盐水纱布覆盖伤口以保持伤口组织的湿润与温度。经静脉注射给药后，立即将分离好的颈动脉置于YLS14B小动物血栓生成仪的探测接头内，启动血栓生成仪，用恒流直流电刺激(1 mA)。记录探头通过红外扫描测量血液的流通量并换算出血管堵塞程度(测量的时间间隔为4 s，以百分数表示数据，全部过程持续5 min)。

　　1.4 统计学处理

　　所有数据以±s表示，采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析及SNKq检验。

　　2 结果

　　观察结果详见表1，结果表明：模型对照组的颈动脉堵塞程度与rAcaNAP9低、中、高3个剂量组比较差异均有统计学意义。表1 rAcaNAP9抗大鼠颈总动脉血栓的效果与模型对照组比较：*P&<0.05，**P&<0.01。

　　3 讨论

　　随着对凝血过程认识的深入，开发针对重要凝血因子特异靶点的药物是目前抗凝抗栓药物的新方向，其中，活化的7号凝血因子(fⅦa)与组织因子(TF)形成复合物(fⅦa/TF)抑制剂是目前抗凝抗栓药物研究主要方向，该类抑制剂可以通过阻断凝血过程启动阶段而达到抗凝抗栓效果[56]。钩虫抗凝素，早在20世纪90年代中期已被陆续分离并被作为抗凝抗栓新药进行研究[1，7]。其中，rNAPc2对fⅦa/TF复合物特异性抑制，是目前正在开发的最具有应用前景的抗凝抗栓新药之一[2，5]，其效果优于目前临床常用的低分子量肝素(LMWH)、华法林和直接凝血酶抑制剂。虽然rAcaNAP9能显著延长血浆凝血酶原时间(PT)，但其延长活化部分凝血活酶时间(aPTT)作用不及延长PT作用明显，我们初步研究表明：rAcaNAP9具有与NAPc2相似的抗凝作用机制，主要是通过抑制fⅦa/TF复合物发挥抗凝作用(待报道)，即对外源性凝血途径具有较强的抑制作用。

　　我们在前期实验中观察到rAcaNAP9对血小板聚集剂-胶原蛋白和肾上腺素诱发的小鼠血栓形成无明显作用。考虑到rAcaNAP9主要是通过抑制fⅦa/TF复合物发挥抗凝抗栓作用，因而我们又试用了大鼠颈总动脉血栓形成模型。该模型的造模原理是：用电刺激大鼠颈总动脉，致局部血管内膜损伤，启动内源性凝血途径，同时释放组织因子，组织因子与fⅦa结合形成fⅦa/TF，从而启动外源性凝血途径而导致血栓形成[4]。在本实验的预实验中，我们观察到rAcaNAP9有明显抗大鼠颈总动脉血栓形成的效果，所以我们选用该模型进行了本实验。

　　本实验中rAcaNAP9低、中、高剂量组的实验数据标准差均大于均值，同时对照组(阳性药)的标准差也较大，这可能是由于测量时因血流量受到诸多因素的影响，致使该观测指标的量化难以精确。另外本实验的样本量较小也是造成方差过大的原因之一，因此扩大样本量作进一步观察是必要的。当然改善观察手段也是非常必要的。

参考文献

　[1] 彭礼飞， 王会兰， 邓莉， 等. 钩虫抗凝血肽的研究现状[J]. 广东医学院学报， 2006， 24(6): 624627.

　　[2] 王会兰， 彭礼飞. 一种独特的fⅦa/TF抑制剂：线虫抗凝血蛋白c2[J]. 中国药理学通报， 2006， 22(2):141 144.

　　[3] 彭礼飞， 吴亚敏， 邓 莉， 等.犬钩虫抗凝肽及其制备和应用:中国，101260150A [P]. [20080910].

　　[4] 李才. 人类疾病动物模型的复制[M]. 北京: 人民卫生出版社， 2008:6062.

　　[5] Weitz J I， Hirsh J， Samama M M.New antithrombotic drugs: American college of chest physicians evidencebased clinical practice guidelines (8th Edition) [J]. Chest， 2008， 133(suppl): 23456.

　　[6] 徐理纳. 抗血栓药//陈修， 陈维洲， 曾贵云. 心血管药理学[M]. 3版. 北京: 人民卫生出版社， 2002:779.

　　[7] 彭礼飞， 杨 陈， 王会兰， 等. 线虫抗凝血蛋白AcaNAP7基因克隆、表达及抗凝活性鉴定[J]. 中国药理学通报， 2007， 23(3): 337341.