【摘要】 目的 探讨膜型Ⅰ型金属蛋白酶（MT1-MMP/MMP-14）在宫颈鳞状细胞癌组织中的表达及临床意义。方法 用免疫组化法检测60点（24例）宫颈鳞状细胞癌、癌旁及其边缘组织组合芯片、21例宫颈鳞癌组织、6例癌旁组织、15枚转移淋巴结组织中MMP-14蛋白的表达情况。收集相关病理学资料进行统计学分析，研究T分期、分化、浸润深度、淋巴结转移与MMP-14蛋白的相关性。结果 MMP-14蛋白在肿瘤细胞的胞浆和胞膜中有强阳性表达。不同期别间的肿瘤细胞胞膜的MMP-14蛋白的强阳性表达率高于胞浆表达率（P＜0.05）。有浸润的肿瘤的癌巢周边的间质细胞有MMP-14蛋白的弱表达。癌旁靠近基底膜的上皮细胞胞浆中有MMP-14蛋白的表达，强阳性表达率为12%。转移淋巴结的肿瘤细胞胞浆中有黄色颗粒，强阳性表达率为3%。正常宫颈组织不表达或弱阳性表达。原位灶与癌旁MMP-14蛋白的表达差异有统计学意义（P=0.000）。癌旁与边缘组织表达差异无统计学意义（P＞0.25）。结论 MMP-14蛋白主要在肿瘤细胞的胞浆及胞膜中表达，其高表达与宫颈鳞癌的淋巴结转移有关，在宫颈癌的浸润、转移中起重要作用，可能成为宫颈鳞癌淋巴结转移的预测因子。
【关键词】 MMP-14；宫颈癌；淋巴转移；组织芯片；免疫组化
Abstract: Objective To investigate the expression of memberane type Ⅰ matric metalloproteinase (MMP-14) in squamous cell carcinomas of cervix and to explore their clinicopathological significance.Methods Tissue microarrays of 24 cases with paired squamous cell carcinoma of cervix，cancer adjacent and adjacent normal tissue and 21 cases with squamous cell carcinoma of cervix，6 adjacted carcinoma tissues and 15 lymph hode were investigated immunohistochemically to determine the level of expression of MMP-14 proteins.Results MMP-14 proteins was noticed to be localized in the cytoplasm and at the cell membrane in carcinoma cells and overexpresssion was found in 41 of 45.Overexpression of adjacent carcinoma tissues was found in 3 of 26.Overexpression of lymph hode was found in 2 of 25.Expression of MMP-14 proteins showed a significant differentce between carcinoma and adjacent carcinoma tissues (P=0.000).No significant differentce was found betweet adjacent carcinoma tissue and adjacent normal tissue(P＜0.05).Expression of MMP-14 protein showed significantly increased in nodal metastasis groups compared with the groups without nodal metastasis (P＜0.05).Over-expression of MMP-14 proteins was related with mascle invasion and regional lymph hode metastasis and was not associated with histologic grade，advanced T stage and advanced tumor stage.Conclusion These results suggested that Overexpression of MMP-14 proteins was associated with invasion and metastasis and it might play a predictive role in lymph hode metastasis and early tumor progression.
Key words:MMP-14；cervical carcinoma；lymphatic metastasis; tissue microarray; immunol histochemistry
子宫颈癌的死亡率在女性恶性肿瘤中仅次于乳腺癌位居第二，宫颈癌的复发和转移仍是治疗失败的主要原因。基底膜的受侵是鳞状上皮细胞肿瘤进展的关键步骤，间质反应已成为鉴别浸润的一个重要指标［1］。膜型Ⅰ型金属蛋白酶（memberane type Ⅰ matric metalloproteinase MT1-MMP/MMP-14）属于基质金属蛋白酶家族的一个亚家族，是一种跨膜蛋白水解酶，可降解基底膜（BM）和细胞外基质（ECM）成份，降解细胞因子、生长因子受体或生长因子连接蛋白，在肿瘤细胞的浸润、转移中起重要的作用［2］。因此，有必要研究MMP-14蛋白在宫颈鳞癌原发灶、癌旁组织、淋巴结中的表达情况与临床病理的关系，视其在肿瘤浸润、转移中的作用。
1 材料和方法
1.1 材料
选取2008年7月至2009年宁夏医科大学妇科宫颈鳞癌患者手术切除标本的存档蜡块21例，癌旁组织6例，转移淋巴结28枚 及60点阵的宫颈鳞癌、癌旁及其边缘组织组合人芯片，年龄30～80岁，中位年龄48岁，全部病例均经病理诊断为宫颈鳞癌。按分化程度：高分化鳞癌4例，中分化鳞癌18例，低分化鳞癌23例。按FIGO（2000年）TNM 分期：Ⅰａ期8例，Ⅰｂ期18例，Ⅱａ期10例，Ⅱｂ 6例，Ⅲ期2例，Ⅳ期1例，术后病理检查证实淋巴转移者15例。
病例入选标准：①无前期手术史。②术前未接受过放射、化学、激素等治疗。③癌组织取自肿瘤部位，癌旁组织取自原位灶边缘外1.5 cm处组织，正常宫颈上皮组织取自癌旁的远端上皮组织并经病理证实无癌细胞浸润，淋巴结取自患者盆腔水平转移的淋巴结。④取材前再次阅片验证诊断，明确病变部位。组织芯片的诊断来自于50μm内的HE染色片，并由免疫组化确认。
1.2 方法
1．2.1组织芯片制作方法：应用组织芯片制作机，将经HE染色确诊为宫颈鳞癌癌灶、癌旁组织、正常宫颈组织取出（直径1.5 mm），按每点距离1.5 mm，调节芯片制造机的纵、横向移动距离，将所选取组织插入到受体蜡块中，制成含72个（72×1）微组织阵列样本的芯片蜡块，然后将制成的阵列蜡块放入37℃温箱中20min，使组织与受体蜡块结合紧密，常规4μm连续切片收于涂有APES的载玻片上备用。
1.2.2 免疫组织化学方法
MMP-14兔多克隆抗体（即用型），SABC免疫组织化学染色剂试剂盒，DAB酶底物显色试剂盒均购于武汉博士德生物有限公司。所有标本均经4%中性甲醛固定，常规脱水、包埋，连续4μm切片。免疫组织化学方法为ABC法。依照免疫组织化学试剂盒说明书进行，抗原修复为EDTA（pH=8.0）高压修复。
1.3 结果判定标准
每个切片选5个视野，每个视野计取100个细胞，得出阳性细胞数的百分比及染色深度，在阅片中发现组织细胞的阳性细胞数大部分在80%以上，极个别在20%～40%，因此仅用细胞染色强度计分。胞浆阳性计分方法：胞浆无染色或阳性细胞数小于10%为（-）；浅黄色为（+）；黄褐色为（++）；棕黄色为（+++）。膜表达阳性细胞的计分方法：＜10%或不完整（未包绕细胞）为（-）；＞10%的癌细胞胞膜染色，染色间断分布，未环绕包膜为（+）；＞10%的癌细胞胞膜弱到中度染色，染色连续，环绕整个包膜为（++）；＞10%的癌细胞胞膜强阳性，染色连续，环绕整个包膜为（+++）。
1.4 统计学分析 采用SPSS 11.5软件进行分析。组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率检验法。等级资料多样本采用Kruskai-Wallis H检验，组间两两用Nemenyi 法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MMP-14蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达
MMP-14蛋白在宫颈鳞癌肿瘤细胞的胞浆胞膜中有棕黄色沉积，部分肿瘤细胞以胞膜表达为主，部分以胞浆为主，肿瘤组织的癌巢周边及浸润灶中的肿瘤细胞表达增强，癌巢周边的间质细胞呈弱阳性表达。在癌旁组织中靠近基底膜的上皮细胞表达较强染色较深。在转移的淋巴结中可见肿瘤细胞的胞浆中有黄色的阳性颗粒。在癌旁和正常宫颈组织中鳞化的上皮细胞胞浆中MMP-14蛋白表达增高，与非鳞化上皮细胞比较差异有统计学意义（P=0.005），图1，见封3。
2.2 MMP-14蛋白在癌灶、癌旁、淋巴结及正常宫颈组织中的表达比较
MMP-14蛋白在宫颈鳞癌不同部位中的表达差异有统计学意义。宫颈鳞癌原位灶与癌旁组织、淋巴结、正常上皮间MMP-14蛋白的表达差异有统计学意义；癌旁组织与淋巴结、正常上皮间MMP-14蛋白的表达差异无统计学意义。正常宫颈上皮不表达或弱表达，见表1。表1 MMP-14蛋白在宫颈鳞癌不同部位中的表达比较（略）
2.3 MMP-14蛋白的表达与临床病理特征的关系
由于Ⅳ期的病例只有1例，将其纳入到Ⅲ期中分析。宫颈癌患者临床分期（Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲ）总体差异有统计学意义（P=0.044），但组与组间比较差异无统计学意义。在淋巴结分期中有一枚淋巴结转移的患者为11例，有二枚及以上者为4例，MMP-14蛋白的强阳性率差异有统计学意义（P=0.004）。不同期别间（Ⅰ期与Ⅱ/Ⅲ期）肿瘤细胞胞膜MMP-14蛋白的强阳性表达率差异有统计学意义(χ2=4.555，P=0.033)。
MMP-14蛋白的表达在不同肿瘤大小（≤4cm与＞4cm）、有无淋巴结转移、不同肿瘤浸润深度间的表达差异有统计学意义，MMP-14蛋白的表达与患者年龄、临床分期、肿瘤组织分级无关，见表2。表2 宫颈鳞癌组织MMP-14蛋白的表达与临床病理特征的关系（略）
3 讨论
Ⅱａ期前宫颈癌患者多以手术治疗为主，并主张对手术后发现的深肌层浸润及淋巴结转移者进行放射治疗，双重的根治性治疗易引起严重并发症。因此，了解肿瘤细胞的生物学行为，治疗前预测有无深肌层的浸润和淋巴结的转移有助于对较早期的宫颈癌选择治疗方式有重大意义。
在肿瘤细胞浸润转移的过程中，肿瘤细胞必须获得突破基底膜和降解细胞外基质的能力。MMP-14蛋白有一个特殊的质膜锚定结构域，因此MMP-14蛋白在细胞内被激活后，在细胞表面表达。本研究中发现在浸润性宫颈癌中MMP-14蛋白的阳性表达率为98%，强阳性表达率为91%，原位灶与癌旁组织MMP-14蛋白的表达差异明显，在间质浸润灶及癌巢边缘的肿瘤细胞有较强的表达，癌巢周边的间质中有MMP-14蛋白弱阳性表达，Ⅰ期与Ⅱ/Ⅲ期肿瘤细胞胞膜MMP-14蛋白的强阳性表达率有差异，提示有膜表达的肿瘤细胞可能更具侵袭性，活性MMP-14蛋白可能降解基底膜或细胞外基质，肿瘤细胞穿透基底膜，促进侵袭和转移。但不是晚期的宫颈癌细胞都有MMP-14蛋白的强表达，可能存在重要辅助因子的缺乏或有MMP-14蛋白抑制因子的表达［3］。
Wiegand等对MMPs在头颈鳞癌淋巴转移的作用进行Meta分析提示MMP-14可能对头颈鳞癌转移的生物学行为有重要意义［4］。在口腔鳞癌研究中MMP-14蛋白的表达与期别肿瘤大小无关，对淋巴转移有预测作用［5］。在本研究中MMP-14蛋白的强表达与肿瘤分期、组织分级、临床分期无关，与淋巴结有无转移、浸润深度有关，提示仅通过肿瘤的大小和临床分期来判断其转移趋势是不够的，MMP-14蛋白的强表达也可能引起浸润和转移，MMP-14蛋白的强表达及间质表达可能是反映宫颈鳞癌淋巴转移、早期浸润的一个较早的指标。
Kamat等用免疫组化研究90例浸润性卵巢上皮瘤中发现MMP-14蛋白在上皮及间质的高表达与低生存密切相关，是低生存的独立预测因子［6］。影响宫颈癌预后的因素中，临床分期、肿瘤分级、淋巴转移、浸润深度等是重要因素。本研究发现MMP-14蛋白的强表达与淋巴转移及浸润深度有关，提示MMP-14蛋白的表达与对宫颈鳞癌患者的预后有影响。因本组资料随访时间短，部分患者不能随访，故未能对生存时间这一指标进行分析。
宫颈癌的侵袭、转移是一个动态的过程，MMP-14蛋白作为一种蛋白水解酶，可降解基底膜和细胞外基质成分，促使肿瘤细胞迁移。MMP-14蛋白的高表达在宫颈癌的浸润中起重要作用，与淋巴转移相关。
参考文献
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