作者：张常喜， 杨爱萍， 谢春毅
【摘要】 目的 观察链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠心肌胶原代谢的动态变化，探讨胶原代谢异常在糖尿病心肌病变中的作用。方法 实验选用清洁级、4周龄、雄性SD大鼠。设正常对照组，分为8周组和12周组;用STZ造模。注射STZ 72h后测空腹血糖值&>16.7 mmol为糖尿病模型，模型大鼠随机分为2组：模型8周组、12周组。分别于8周、12周后腹主动脉采血分离血清，测血清总胆固醇、低密度脂蛋白、糖化血清蛋白、醛固酮、内皮素-1(ET-1)。采用天狼星红染色法测心肌胶原含量，免疫组化测转化生长因子1(TGF-β1)。结果 最终进入结果分析35只。模型8周组、12周组大鼠血糖水平、心肌胶原含量、糖化血清蛋白(GSP)、ET-1、醛固酮、总胆固醇、低密度脂蛋白及心肌TGF-β1水平均明显高于相应正常对照组(P&<0.05);且模型12周组较8周组大鼠心肌胶原含量和心肌TGF-β1表达明显增加(P&<0.05)。结论 糖尿病大鼠8周时即心肌胶原代谢异常，随病程进展心肌胶原沉积呈进行性增加，且伴随糖、脂、蛋白代谢异常，内皮素、TGF-β1和醛固酮的增加可能是导致心肌胶原早期沉积的因素。
【关键词】 糖尿病;心肌病胶原;内皮素ET-1;醛固酮;转化生长因子TGF-β1
Sunni等[1]认为糖尿病病变中心肌胶原的沉积和心肌细胞的增生、肥大均是糖尿病心肌病(DC)发生发展的病理因素，因此深入研究糖尿病心肌胶原代谢的特点十分必要，本研究拟探讨糖尿病大鼠心肌胶元代谢异常的相关因素，以及心肌胶元异常沉积的时间点与相关的代谢特点。
1 材料和方法
1.1 实验动物 选用清洁级、体重(210±20)g，SD雄性大鼠60只，上海复旦大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK沪2002-0002。动物饲养温度25℃，湿度40%。
1.2 试剂 链脲佐菌素(STZ)、天狼猩红购自美国Sigma公司;转化生长因子1(TGF-β1)兔抗鼠一抗：购自美国Santa Cruz公司;内皮素1(ET-1)ELISA试剂盒：购自上海森雄科技实业有限公司，进口分装;醛固酮(ALD)放免试剂盒：购自上海达为科生物科技有限公司，进口分装;糖化血清蛋白(GSP)、总胆固醇(T-CHO)、低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒均购自南京建成生物工程公司，国产;血糖试纸：德国罗氏公司。
1.3 主要仪器设备 万能研究用显微镜，日本Olympus公司(BX51型);图像分析系统，德国ZEISS公司，Axioskop-plus;图像分析软件，IMAGE-PRO PLUS (VER 4.1);分光光度计，UV-2102C 2.1：上海精密科学仪器有限公司(仪器编号：SFZ 1606016686);血糖仪，德国罗氏公司。
1.4 方法
1.4.1 动物分组及处理 雄性SD大鼠40只，随机取17只分为正常8周(8只)、12周(9只)对照组;正常饲养，不予特殊处理。其余23只大鼠禁食12h后，按55mg/kg体重腹腔内注射浓度为1mg/mL的STZ(用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液溶解配制，pH 4.2)。注射STZ 72h后用罗氏血糖仪测定大鼠尾尖空腹血糖，血糖值&>16.7 mmol/L，动物多饮、多食及尿量增加者确定为糖尿病模型，少数几个血糖升高但不合格者，按30 mg/kg体重腹腔内注射浓度为1mg/mL的STZ，72h后再测定大鼠血糖，血糖值&>16.7 mmol/L，有症状者纳入糖尿病大鼠分组，不合格者剔除。最后有20只糖尿病造模成功大鼠，将其随机分为2组：模型8周组、12周组，每组10只。实验持续12周，实验过程中每4周监测血糖1次。
分别于8周、12周后大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉采血约10mL，分离血清，采血后取出心脏除去心房、留取心室肌组织(用生理盐水冲洗后再用滤纸吸干净多余的水份)，称重后用10%甲醛固定，24h后逐级酒精脱水、二甲苯脱水、58℃石蜡包埋，5μm厚切片，做病理、免疫组化检测。
1.4.2 血清学指标检测 分光光度计检测、通过相应试剂所给公式算总胆固醇、低密度脂蛋白和糖化血清蛋白水平。ELISA法检测大鼠血清中ET-1含量，放免法测定血清醛固酮水平。
1.4.3 心肌胶原与TGF-β1检测 采用天狼星红染色法测心肌胶原含量，结果判定：天狼星红染色组织中红色为阳性胶原，采用图像分析软件对染色阳性物质进行测定，计算灰度均值和阳性面积百分比;免疫组化法测TGF-β1染色组织中棕黄色为阳性表达，采用图像分析软件对染色阳性物质进行测定，测每张切片6个视野(400倍)TGF-β1阳性面积百分比，计算每张片子的六个视野的平均值，平均值用于统计。
1.5 统计学方法 多样本均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，均由 SPSS 12.0统计软件完成。
2 结果
因造模失败、实验中途死亡等，最后进入分析的大鼠35只：正常8周组8只，正常12周组8只，糖尿病8周组9只，糖尿病12周组10只。除正常大鼠组，糖尿病组大鼠均出现多食、多饮、多尿、消瘦等症状。本组实验进行到第3个月时糖尿病12周组有6只动物眼睛出现了白内障。
2.1 糖尿病大鼠心肌胶原含量 见表1。
实验8、12周时，模型组大鼠心肌胶原含量明显高于正常对照组(P&<0.05);且模型12周组大鼠心肌胶原含量明显高于8周组(P&<0.05)。如图1所示(见封4)，图中红色为心肌胶原部分，正常对照两组胶原沉积不明显，模型两组胶原沉积明显增加，其中模型12周组较8周更明显。表1 糖尿病大鼠心肌胶原含量
2.2 糖尿病大鼠血糖及糖化血清蛋白的变化 见表2。 表2 糖尿病大鼠血糖及糖化血清蛋白的变化
2.3 糖尿病大鼠血脂的变化 见表3。表3 糖尿病大鼠血脂的变化
2.4 糖尿病心肌病大鼠醛固酮及ET-1 水平、糖尿病大鼠心肌TGF-β1表达 见表4。
表4 糖尿病心肌病大鼠醛固酮及ET-1 水平、心肌TGF-β1表达
3 讨论
近年来随着我国人民生活水平的提高，饮食结构的改变，糖尿病的发病率持续上升。糖尿病及其并发症对人民的身体健康构成了严重的威胁。糖尿病心脑血管并发症是致死致残的主要原因。其中以DC的危害性最大[2]。因此，加强对DC的基础与临床研究具有重要的学术价值和社会效益。在DC的发病机制中，当前主要集中于高血糖引起心肌细胞凋亡和心肌细胞外基质的改变，这两方面是心肌增厚、舒张和收缩功能障碍的直接原因;其中，细胞外基质的改变主要是由于心脏胶原纤维增多所致，由此导致的心室壁僵硬度增加是导致心功能异常的重要原因之一[3]。Sunni等认为心肌间质胶原沉积的发生可能早于心肌细胞的增生、肥大。通过本实验发现，糖尿病大鼠在第8周时心肌组织中胶原含量明显增加，明显早于部分学人认为的糖尿病心肌胶原12周出现沉积的时间段[4]，说明糖尿病状态下伴随早期糖、脂、蛋白的代谢紊乱心肌组织中胶原已经开始沉积。而且本结果中模型12周组较8周组大鼠心肌胶原含量明显增多，说明随着糖尿病程的发展心肌胶原在间质的沉积表现为进行性成倍增长，当然此时也存在胶原类型所占比例的改变[4]。
现在认为糖尿病者心肌病发生率高，经有效降低血糖水平后，可明显改善糖尿病心肌病变的预后，这与糖尿病病程的发展、心肌胶原在间质的沉积有关。糖尿病伴有循环和心脏局部ET-1、TGF-β1的激活，其中ET-1是最为重要的活性物质[5-6]。本实验也发现，糖尿病大鼠在病程第8 周时表现为循环ET-1水平的升高，随时间的变化糖尿病大鼠血清ET-1逐渐表现为下降态势，但仍然处于较高水平，ET-1不仅可促进心肌成纤维细胞分泌基质蛋白，还可促进成纤维细胞的合成和细胞数目的增加。ET-1的增加可促进TGF-β1、肿瘤坏死因子α(TNFα)等多种细胞因子的表达，最重要的是TGF-β1。因此有研究认为ET-1引起心肌胶原沉积主要是通过TGF-β1增高所介导的[7]。本实验中观察到ET-1与TGF-β1的变化有关系，且我们在本实验中发现醛固酮对糖尿病大鼠8周和12周时的心肌胶原含量有影响，血管分泌的醛固酮引起胶原基因表达增强，胶原等蛋白合成增多，从而引起心血管重构[8]。因此，伴随糖、脂代谢异常引起内皮素、TGF-β1和醛固酮的增加可能是导致心肌间质胶原早期沉积的因素。
参考文献
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