【摘要】 目的探讨TLR9在胃癌细胞MGC803上的表达及其激动剂对MGC803细胞增殖和凋亡的影响。方法用RT-PCR方法检测MGC803细胞上TLR9的表达;用TLR9的激动剂CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligodexynucleotides， CpG-ODN)10 μg·mL-1分别作用MGC803细胞24、48 h和72 h后，用MTT法检测细胞生长抑制率;流式细胞术观察CpG ODN作用MGC803细胞24 h后的细胞凋亡现象。结果MGC803细胞上有TLR9的表达;TLR 9激动剂CpG ODN作用于MGC803细胞不同时间点，均能明显抑制MGC803细胞生长(P&<0.01)，以早期凋亡为主。结论TLR9激动剂CpG ODN对胃癌细胞的生长具有抑制作用。
【关键词】 CpG ODN;MTT;胃癌细胞;TLR9
肿瘤作为临床常见的恶性病，严重威胁着人类的生命。恶性肿瘤死亡第1位的是肺癌，其次为肝癌和胃癌[1]，且逐年递增。Toll样受体(Toll-like receptors， TLRs)是一类新近发现的能识别微生物，特别是细菌和病毒的模式识别受体(pattern recognition receptor， PRR)，介导固有免疫反应并桥接或触发适应性免疫。近年研究发现，TLRs可在各种肿瘤细胞中表达，参与肿瘤免疫监视，并对肿瘤的生长发挥不同的作用[2]。本研究以胃癌细胞系MGC803细胞为研究对象，通过观察MGC803细胞上TLR9的表达及TLR9激动剂寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)对MGC803细胞生长的影响，探讨TLR9在胃癌发生发展中的可能作用。
1材料和方法
1.1材料
RPMI1640培养基，为GBICO公司产品;四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Amresco公司;新生牛血清为民海生物公司产品;TLR9引物及其激动剂CpG ODN 1826由北京赛百盛生物基因技术有限公司合成。逆转录试剂盒购于Fermentas公司;SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购自美国应用生物公司。MGC803细胞为本室保存，TRIZOL试剂为Invitrogen原装产品。
1.2方法
1.2.1合成TLR9引物及其激动剂CpG-ODN 1816
TLR9引物序列为：5′-GGACACTCCCAGCTCTGAAG-3′(上游引物)，5′-TTGGCTGTGGATGTTGTTGT-3′(下游引物);内参为β-actin(上游引物：5′-TAGAGATTGGAGGTTGTTCCT-3′;下游引物：5′-TCCACCAACTAAGAACGGCC-3′)。TLR9激动剂CpG-ODN 1816序列如下：5'-tcc atg acg ttc ctg acg tt-3' ，全程硫代修饰。总RNA采用TRIZOL试剂提取， 以其为模板严格按照反转录试剂盒说明书要求逆转录合成cDNA，然后采用25 μL反应体系，按以下条件对TLR9及内参照β-actin同时进行PCR扩增：94℃预变性5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环，最后72℃延伸5min。反应完毕，取10 μL PCR产物在1.5%琼脂凝胶中进行电泳。电泳完毕后，在凝胶分析仪下进行观察并同时成像。
1.2.2MGC 803细胞的培养
按常规方法用含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养液，在37℃、5% CO2、饱和湿度的孵箱中培养。取处于对数生长期且细胞活性大于98%的细胞进行实验。
1.2.3MTT法检测细胞增殖活性
调整细胞浓度为2 ×107·L-1。实验分为2组：阴性对照组和加药组，每组设3个平行孔。96孔培养板中每孔加入90 μL细胞、10 μL CpG-ODN(10 μg·mL-1)或培养液，分别作用24、48 h和72 h后，终止培养。每孔加入MTT(终浓度为5 μg·mL-1)10 μL，37℃孵育3h后，选择450 nm 波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔A值。
1.2.4FCM检测细胞凋亡
收集105个经10 μg·mL-1 CpG ODN作用24 h后的细胞，离心弃去上清，用PBS洗涤2遍后，重悬细胞，加入5 μL AnnexinV 室温避光孵育10min后，用PBS洗1遍，加入10 μL碘化丙锭(PI)后上流式细胞仪检测。
1.3统计学方法
全部数据采用SPSS 11.0处理，计量资料的组间比较用t检验。P&<0.05 为差异有统计学意义。
2结果
2.1TLR9在MGC803 细胞的表达
经RT-PCR法测定MGC803细胞有TLR9 mRNA的表达(见图1)。1.Marker;2.TLR9;3.β-actin图1RT-PCR扩增产物电泳图
2.2CpG ODN对MGC 803 细胞生长的抑制作用
10 μg·mL-1 CpG ODN作用于MGC803细胞24、48 h和72 h后，用MTT法检测细胞增殖活性，结果见表1。表1TLR9激动剂CpG ODN对MGC803细胞增殖的影响
2.3CpG ODN作用MGC803 细胞后细胞凋亡的测定
10 μg·mL-1 CpG ODN作用于MGC803细胞24 h后，用流式细胞术(FCM)测定细胞凋亡(结果如图2 Q4区所示)，CpG ODN可促进MGC803细胞的早期凋亡。(注：Q1区，细胞收集过程中出现的损伤细胞;Q2区，凋亡中晚期细胞;Q3区，活细胞;Q4区为早期凋亡细胞)图2激动剂作用24h后的细胞凋亡(注：Q1区，细胞收集过程中出现的损伤细胞;Q2区，凋亡中晚期细胞;Q3区，活细胞;Q4区为早期凋亡细胞)图3细胞双染色对照组
3讨论
TLR受体不仅表达在免疫细胞中介导免疫应答，近来有研究发现，肿瘤细胞也可以表达TLRs。如TLR9在肺癌、前列腺癌、卵巢癌 [3-5]中均有高水平的表达;大量的临床研究也证明了TLRs表达的上调与胃癌、肺癌等发生、发展可能有密切关系。Droemann等[6]采用免疫组化和共焦显微镜的方法检测肺癌组织中TLR9的表达量，其结果显示在多数肺癌的肿瘤细胞胞质中有高强度的TLR9表达，同时在肺癌多个细胞系中也证明了这一点;与此相反，在癌旁正常肺组织中只有零星的微弱表达。本实验检测到在胃癌细胞上有TLR9的表达，且TLR9激动剂CpG-ODN对胃癌细胞MGC803作用的三个时间点都能明显抑制细胞的生长，流式细胞术凋亡测定表明细胞凋亡主要发生在早期，但TLR9的激动剂抑制胃癌细胞增殖的具体机制尚不清楚。
研究发现TLR9在肿瘤上的表达可为肿瘤的化疗、免疫治疗提供新方法[7]。TLR9的配体是细菌和病毒DNA中的CpG基序或人工合成的寡脱氧核苷酸基序。CpG-DNA可进入树突状细胞(DC)，在溶酶体区域，与TLR9特异性的作用，然后通过衔接子MyD88激活下游信号通路，最终导致类浆细胞DC的活化并成熟为专职APC。这些成熟的APC表面表达共刺激分子(CD80、CD86)、趋化因子受体CCR7;分泌Thl型细胞因子(Ⅰ型IFN、IL-10)。在此影响下，NK细胞活化，中性粒细胞表面Fc受体表达增加，ADCC活性增强，进一步引起更多类浆细胞DC活化成熟、抗原提呈，从而增强宿主对肿瘤细胞的直接清除作用。在Th1型细胞因子的环境中，即便是没有CD4+T细胞的辅助，也能够诱导特异性CD8+T 细胞应答，进而提高宿主对肿瘤细胞的识别及清除能力。本实验证实TLR9激动剂CpG-ODN能抑制胃癌细胞的增殖，对胃癌的免疫治疗具有潜在的应用前景，其具体作用机制将是进一步研究的重点。
参考文献
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