中药抗癌灵对肝癌SMMC7721细胞增殖的影响

　　　　　　作者：韦鹏涯，浦洪琴，韦星，李朝敢，农嵩

【摘要】 　　目的 观察中药抗癌灵（Kangailing， Ka）对人肝癌SMMC7721细胞增殖的影响并探讨其可能分子机制。方法 提取、配制不同抗癌灵生药浓度，作用于体外培养的人肝癌SMMC7721细胞，采用MTT法检测细胞增殖抑制率，流式细胞仪法检测凋亡率，二步法免疫组化检测野生型P53、NFкB P65和Bcl2蛋白表达变化。结果 与正常对照组比较，Ka各浓度组细胞抑制率显著上升（P＜0.001），细胞凋亡率明显升高（P＜0.01或P＜0.001），P53蛋白表达显著上升（P＜0.001），NFкB和Bcl2蛋白表达明显下降（P＜0.001）。结论 Ka通过诱导细胞凋亡而抑制肝癌SMMC7721细胞增殖，其分子机制可能与上调野生型P53蛋白表达，下调NFкB P65和Bcl2蛋白表达有关。

【关键词】 中药 抗癌灵 肝癌 细胞增殖 细胞凋亡 基因表达

　　【Abstract】 Objective To observe the effects of traditional Chinese medicine Kangailing on proliferation in human hepatoma SMMC7721 cell lines in vitro and investigate its possible molecular mechanism.Methods The proliferation inhibitory rate was evaluated by MTT assay. Apoptotic rate was determined by flow cytometry. The expression of wild type P53，NFкB P65and Bcl2 proteins were detected by twostep immunhistochemical staining.Results The cell inhibitory rate and apoptotic rate and the expression of P53 Protein of Ka treatment groups increased obviously than that of control group (P＜0.001)， while NFкB P65and Bcl2 Proteins were decreased markedly(P＜0.001). Conclusion Kangailing could inhibit the proliferation of SMMC7721 cells in vitro by inducing cancer cell apoptosis， and its molecular mechanism may be associated with the upregulation ofthe expression of wild type P53 protein and downregulation of the expression of NFкB P65and Bcl2 proteins.

　　【Key words】 traditional Chinese medicine;Kangailing;liver cancer;proliferation;apoptosis;gene expression.

　　肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病，也是细胞凋亡异常的疾病。越来越多证据表明，中药抗癌的疗效与中药诱导肿瘤细胞凋亡有关。许多天然药物可以通过干扰肿瘤细胞生长、代谢和增殖等过程，最终诱导触发肿瘤细胞发生凋亡，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的作用［1，2］。复方中药抗癌灵(Kangailing，Ka)由白英、白花蛇舌草、半枝莲和半边莲等中草药组成，具有清热解毒、活血化瘀等功效。临床上该复方广泛应用于各种癌症的治疗，尤其对肝癌、肺癌、胃癌及鼻咽癌等有较好的疗效。本研究通过观察中药Ka对人肝癌SMMC7721细胞增殖作用的影响，旨在探讨其分子作用机制，为该复方中药应用于肝癌的临床治疗提供理论依据。

　　材料和方法　　

　　1.材料

　　人肝癌SMMC7721细胞株由中科院上海细胞生物研究所细胞库提供，胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基为GIBCO公司产品，四甲基偶氮唑蓝（MTT）为上海普飞生物技术有限公司产品，碘化丙啶(propidium iodide，PI)为Sigma公司产品，鼠抗人NFкB P65、野生型P53和Bcl2单克隆抗体为Santa cruz公司产品，PowerVisionTM免疫组化检测试剂盒为北京中杉金桥生物技术公司产品。KHBLabsystems K3酶标仪（芬兰雷勃公司），BX51型显微镜（OLYMPUS，日本），流式细胞仪(Becton Dickinson，USA) 。
　　
　　2.方法

　　（1）药物提取 取复方中药抗癌灵(购买于百色市中医院中药房)干品100 g，用1000 ml水浸泡1 h，加热煮沸后小火煎熬60 min，室温冷却，120目网筛过滤，弃药渣，滤液离心(3 000 r/min×20 min×2次)。取上清液，浓缩至50 ml，调pH值为7.0～7.2，0.22 μm过滤除菌，获生药含量为2.0 g/ml 的Ka水提液，5 ml/瓶分装，-20℃保存备用，实验时将含10&ûS的RPMI 1640培养液稀释至所需的药物浓度。

　　（2）细胞培养和实验分组

　　体外培养人肝癌SMMC7721细胞，以含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10% FBS的RPMI 1640培养液，在37℃、5%CO2的培养箱中培养，细胞生长至对数增殖期，取生长良好的细胞做实验。细胞随机分为对照组（不加药物处理）和Ka组（浓度分别为10、20、40 ml/L）。药物作用时间均为24 h。
　　
　　（3）细胞抑制试验(MTT法)

　　将对数生长期的SMMC7721细胞移入96孔培养板中，细胞密度约为1×104个/ ml，每孔加入200 μl细胞悬液，培养24 h。吸弃孔内原培养液，加入含抗癌灵提取液的10&ûS的RPMI 1640培养液200 μl，每个药物浓度设4个平行复孔。培养到20 h，每孔加入MTT（5 mg/ml）20 μl，继续培养4 h后终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 150 μl，用震荡混合仪震荡10 min，使结晶充分溶解。选择492 nm波长酶标仪测定每孔光吸收值（OD值）。实验重复2次。按下列公式计算抑制率：抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

　　（4）流式细胞仪检测细胞凋亡

　　药物作用24 h后，收集各组细胞约2×105个，1 000 r/min离心5 min，弃去培养液；PBS冲洗两次，加入70%预冷的乙醇固定，4℃，1～24 h；离心弃去固定液，PBS冲洗去乙醇；PBS重悬细胞，400目筛网过滤1次，离心弃去PBS；加入RNase A (终浓度为60 μg/ml)，摇匀，37℃温育30 min，加入PI(终浓度为50 μg/ml)， 4℃避光30 min；流式细胞仪检测，每份标本测定(2～4)×103个细胞，采用Modifit Lt软件分析。

　　（5）免疫组化法检测基因蛋白表达

　　按照二步法免疫组化检测试剂盒说明书操作：药物处理细胞24 h后，收集各组细胞，PBS冲洗两次，制成细胞悬液涂片，风干后丙酮固定15 min；3%过氧化氢孵育5 min，以阻断内源性过氧化物酶；滴加一抗（稀释1∶100），室温90 min，PBS冲洗，2 min×3次；滴加IgG抗体HRP多聚体20～30 min，PBS冲洗，5 min×3次；用DAB溶液显色；蒸馏水冲洗、苏木素衬染、脱水、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果分析：P53蛋白定位于细胞核，细胞核染为棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞；NFκB和Bcl2蛋白定位于细胞浆，细胞浆染为棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。利用CMLAS彩色病理图像分析系统（北京航空大学空军总医院研制）进行分析。随机计数低倍镜下10个视野中的阳性细胞占该视野细胞总数的比率，得出每组细胞的阳性率。
　　
　　3.统计学处理

　　计量资料以均数±标准差（-±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。结　　果　　1.各组SMMC7721细胞抑制率和凋亡率的比较 Ka各浓度组的细胞抑制率均显著高于对照组（P＜0.001），细胞凋亡率显著高于对照组（P＜0.01或P＜0.001）。表1。表1 各组SMMC7721细胞抑制率和细胞凋亡率的比较()注：与对照组比较，△P均＜0.01，▲P均＜0.001。

　　2.各组SMMC7721细胞基因蛋白表达的比较

　　与对照组比较，Ka各浓度组细胞的P53蛋白表达明显上升（P＜0.001），NFκB和Bcl2蛋白表达明显下降（P＜0.001）。见表2。表2 各组SMMC7721细胞基因蛋白表达比较(略)注：与对照组比较，▲P均＜0.001

　　讨 论

　　白英、白花蛇舌草、半枝莲、半边莲、莪术等属于传统的抗肿瘤中草药，从中药药理功能分析，又具有清热解毒、活血化瘀、利水除湿及破症攻毒之功效。本实验用MTT法检测中药复方Ka提取液对人肝癌SMMC7721细胞增殖的抑制作用，结果显示，Ka对肝癌SMMC7721细胞具有较强的杀伤能力；流式细胞检测发现，SMMC7721细胞凋亡率随着药物浓度增高而明显上升。提示诱导细胞凋亡是Ka提取液抑制SMMC7721细胞增殖机制之一。

　　凋亡细胞是多种基因互相作用、综合调节的结果［3］。大量的研究证实：野生型P53是一种抑癌基因，能够在各种条件下引导或促进细胞凋亡。Bcl2是一种调控死亡的“存活基因”，是一种广义的抑制凋亡基因，Bcl2高表达可抑制细胞凋亡，多种化疗药物及中药的抗肿瘤活性均与Bcl2基因表达下调有关［4］。从本实验结果推测，Ka诱导SMMC7721细胞凋亡与上调P53和下调Bcl2基因蛋白表达有关。

　　NFκB（nuclear factorkappa B，NFκB）是细胞内一种重要的核转录因子，近年来的研究显示，NFκB在肿瘤的抗凋亡机制中起重要作用。目前，NFκB主要通过以下三条途径来抑制细胞凋亡［5］：①NFκB通过调控细胞因子而参与自身及其它细胞凋亡。②NFκB通过诱导或上调凋亡抑制基因抑制细胞凋亡。③NFκB通过诱导肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptorassociated factor，TRAF)和凋亡抑制蛋白IAP抑制细胞凋亡。从本实验结果来看，Ka提取液可能通过抑制NFκB基因的表达，达到下调其它凋亡抑制基因或因子，以及解除其对促凋亡基因或因子的抑制作用，从而促使SMMC7721细胞凋亡。

　　总之， Ka通过诱导细胞凋亡而抑制肝癌SMMC7721细胞增殖，其分子机制可能与上调野生型P53蛋白表达，下调NFкB P65和Bcl2蛋白表达有关，但其确切机制有待进一步研究。

参考文献

　　［1］Fador V A，Hemson D.Phagocyto Recognition of Cells Undergoing Apotosis［J］.J Immunol，1992，148(2):207-209.

　　［2］Kieita T，Ohnishi K，Ohnishi T.A new strategy for cancer therapy based on a predictive indicator［J］.Human Cell，2001，14(1):1-5.

　　［3］Raff Mc.Social controls on cell survival and cell death［J］.Nature，1992，356:397-400.

　　［4］Konturek PC，Konturek SJ，Sulekovxa Z， et al.Expression of hepatocyte growth factor，transforming growth factor alpha，apoptosis related proteins Bax and Bcl2，and gastrin in human gastric cancer［J］.Aliment pharmacol ther，2001，15:989-999.

　　［5］朱 波.核转录因子κB与细胞凋亡［J］.国外医学·临床生物化学与检验学分册，2001，22(1):18-19.