作者：张利芳 张亚琼 邢少姬 韩丽红
【摘要】 目的：克隆人血管抑素K1-3基因，构建重组酵母胞内表达质粒PHIL-D2/K1-3。方法：从胎儿肝脏组织用反转录-聚合酶链式反应技术(RT-PCR)扩增人血管抑素K1-3目的基因，克隆至酵母胞内表达质粒PHIL-D2中，线性化后转化毕赤酵母GS115菌株，用Sourthern杂交筛选获得阳性重组转化子。结果：用RT-PCR方法成功扩增到750 bp大小的人血管抑素K1-3基因片段，并正向插入毕赤酵母染色体基因组。结论：人血管抑素K1-3基因成功整合到毕赤酵母GS115基因组。
【关键词】 人血管抑素K1-3;PHIL-D2;毕赤酵母GS115
血管抑素是目前肿瘤研究的热点，研究发现它能特异性抑制肿瘤新生血管的形成，因而能够强烈抑制肿瘤[1]，在临床有良好的应用前景。天然血管抑素来源有限，利用基因工程技术将血管抑素基因克隆获得重组蛋白有重要意义。本文成功从胎儿肝脏组织用反转录—聚合酶链式反应技术(RT-PCR)扩增了人血管抑素基因的有效片段，并构建了重组表达载体，为下一步血管抑素在毕赤酵母胞内的表达创造了条件。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 限制性内切酶、PMD18-T载体、T4 DNA连接酶、PCR试剂盒均购于宝生物工程(大连)有限公司;逆转录酶、DNA抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒购于Promegra公司;酵母转化试剂盒购于Invitrogen公司。
1.2 质粒、菌株和细胞 大肠杆菌DH-5α菌株、Pichia pastoris GS115菌株、PHIL-D2真核表达质粒均由长春生物制品研究所生物技术室提供。
1.3 人血管抑素引物 北京三博生物技术公司合成。
P1:5’CCGAATTCATGTGCAAGACTGGGAATGGAAAG 3’
P2:5’TTGAATTCTTAACAGGACGGTATCTTACA 3’
1.4 人血管抑素K1-3基因片段的扩增 以1 mL TRIzol试剂提取胎儿肝脏(约30 mg)的总RNA，以其为模板，利用设计引物进行PCR扩增，PCR参数为:94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s共30个循环，结束后，72 ℃继续延伸10 min，然后置琼脂糖(1 %)凝胶电泳，并回收PCR产物。
1.5 pMD18-T/K1-3质粒构建 将扩增产物K1-3基因片段克隆入载体pMD18-T，用EcoRⅠ与HindⅢ双酶切鉴定，并测序。
1.6 PHIL-D2/K1-3质粒构建 pMD18-T/K1-3与PHIL-D2同时用EcoRⅠ限制性内切酶进行酶切，产生共有的粘性末端，再用T4 DNA连接酶连接，构建表达载体PHIL-D2/K1-3。用SacⅠ(PHIL-D2载体上距EcoRI酶切位点735 bp处)和PstⅠ(K1-3基因片段5’端150bp处)双酶切鉴定正反连接。
1.7 重组酵母转化子的筛选 将K1-3/PHIL-D2重组质粒用NotⅠ线性化后转化毕赤酵母(GS115菌株)中，用Southern杂交法筛选出阳性重组酵母转化子，以原始GS115菌株和转化了空白PHIL-D2质粒的GS115菌株为空白对照。
2 结果
2.1 pMD18-T/K1-3质粒构建 设计特异引物用RT-PCR方法从胎儿肝脏扩增人血管抑素K1-3目的基因，克隆入pMD18-T，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定得到预期750 bp大小的特异性条带，见图1。经DNA测序，此基因片段与发表的人血管抑素cDNA序列完全一致。pMD18-T/K1-3质粒构建成功。
2.2 PHIL-D2/K1-3质粒构建 用SacⅠ和PstⅠ双酶切K1-3/PHIL-D2重组表达质粒，出现小于1 000 bp的目的带(若反接将出现大于1 000 bp的带)，与预期结果相符，见图2。表明K1-3基因片段正向克隆入PHIL-D2，PHIL-D2/K1-3质粒构建成功。
2.3 重组酵母转化子的筛选 将PHIL-D2/K1-3质粒转化入毕赤酵母GS115，重组子将发生K1-3与酵母组DNA整合。提取转化后毕赤酵母的DNA，标记上述RT-PCR扩增的K1-3基因为探针，用Southern杂交法筛选阳性克隆。结果有部分菌株阳性斑点，说明有K1-3基因的整合，筛选出阳性重组转化子，见图3。对照未显色。
3 讨论
研究表明，血管抑素是血浆纤溶酶原的内部裂解片段。纤溶酶原有5个三环结构域，称做Kringle区。血管抑素则具有前4个Kringle区和部分的Kringle 5区。研究证实，起抑制血管生成作用的结构可能主要是Kringle区，并且不同的Kringle区所起的作用也不同。Kringle 1-3区抑制内皮细胞增殖作用，与血管抑素基本相同。Kringle 1-3是血管抑素的有效片段[1-4]，所以本课题选择该片段克隆，为以后对表达蛋白的生物活性的测定奠定基础。
本课题选择的是二代甲醇毕赤酵母表达系统，有以下优势：(1)高效表达：具有受甲醇诱导的醇氧化酶(AOXI)启动子，在转录水平可严格控制外源基因的高效表达;(2)高表达量：由于毕赤酵母生长快，能够达到很高的细胞浓度，加上强的AOXI基因启动子，表达外源蛋白产量一般较高;(3)可对表达蛋白进行类似哺乳动物细胞的加工折叠和翻译后修饰，如磷酸化、糖基化、二硫键形成等等，从而使表达的蛋白具有生物活性;(4)高稳定性：外源基因通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上，随染色体一起复制和遗传，不会发生外源基因的丢失。
目前在国内外还没有在毕赤酵母胞内表达的文献报道。在毕赤酵母胞内表达有几点优势：表达量相对胞外较高，对培养基及发酵条件要求不高，不易造成蛋白质的降解，更容易实现高密度发酵表达目的蛋白等[5]。本实验目的就是要研究人血管抑素K1-3在毕赤酵母胞内表达的情况，以为血管抑素的进一步研究提供基础。
参考文献
[1] Stathakis P，Lay AJ，Fitzgwrald M，et al.Angiostatin formation involves disulfide bond reduction and proteolysis in kringles 5 of plasmin[J].J Biol Chem，1999，274(13):8910-8916.
[2] 邵秋菊，袁梦晖，徐海峰.血管生成抑制素在实体瘤治疗中的研究进展[J].肿瘤防治杂志，2004，10(3):332-334.
[3] Ji WR，Castellino FJ，Chang Y，et al.Charaterization of kringle domains of angiostatin as antatagonists of endothelial cellmigration ，an important process in angiogenesis[J].Faseb J，1998，12(15):1731-1738.
[4] Ji WR，Barrientos LG，Linas M，et al.Selective inhibition by kringle 5 of human plasminogen on endothelial cell migration，an important process in angiogenesis[J].Biochem Biop Hys Res Commu，1998，247(2):414-419.
[5] 黄坚，龙青，任启生，等.重组rPA基因在毕赤酵母中的胞内表达研究[J].中国生化药物杂志，2003，24(2):58-61