【关键词】 实验性脑缺血模型 建立 影响因素
缺血性脑血管病(ICVD)约占全部脑血管病的80 %[1]，其发病率、致残率、病死率高，已成为严重危害人类健康的疾病之一。因此，模拟人类ICVD的发病过程，建立重复性好、观测指标易于控制的脑缺血动物模型一直是人们普遍关注的课题。在众多动物中，啮齿类动物因其价格便宜、来源充足、制作模型方法简单、存活率高、脑血管解剖和生理接近于人类，故被广泛用作脑缺血及缺血再灌注模型。现将脑缺血动物模型的制备、影响因素以及评价指标作一综述。
1 脑缺血模型的制备
1.1 大鼠全脑缺血模型
1.1.1 双血管闭塞法 1972年由Eklof等首先建立，方法为结扎大鼠双侧颈总动脉(CCA)，并控制动脉血压为50mmHg，缺血5～20分钟，即可造成全脑缺血模型[2]。制造低血压有两种方案:通过尾动脉放血降低血压，或使用降压药酚妥拉明把血压降到50mmHg。以后又做了一些改良，如颈部软组织加压，或通过剪尾放血、腹腔注射硝普钠、颈总静脉处置管抽血等方法降低血压。优点是操作简单方便，失败率低，动物存活率相对较高;缺点是常因存在侧支循环而造成缺血不完全，血压的轻微波动会影响实验结果。
1.1.2 三血管闭塞法 由Kameyama等[3]建立，用电凝切断基底动脉，并通过阻断与开放双侧CCA，实现全脑-缺血再灌流。此法手术损伤稍大，操作不当易造成动物死亡;但模型稳定性好，可通过阻断CCA的时间长短来控制缺血程度，模型成功率高。
1.1.3 四血管闭塞法(4-VO) 1979年由Pulsinlli等[4]首先建立，后正中切口，用小的单极电凝针电凝双侧椎动脉，造成永久性闭塞;前正中切口，夹闭双侧CCA，建立全脑缺血模型。此模型优点是可产生严重的脑缺血，放松动脉夹可进行再灌注实验;缺点是成功率低，对动物损伤极大，动物死亡率高。Todd在此基础上进行了改进，采用了钻透第一颈椎小孔的方法直视下直接烧灼椎动脉，成功率几乎100 %[5]。也有学者将Pulsinlli法使用的单极电凝针改为双极电凝针，并且用钢丝插入翼突孔间接烧灼椎动脉，改进后的方法更简单、实用、成功率高。张更等[6]取颈正中切口烧灼椎动脉，这种单纯腹侧手术入路的4-VO法使动物创伤明显减少，死亡率大幅下降。
1.1.4 七血管闭塞法 阻断包括双侧颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)分支翼腭动脉(PPA)、基底动脉和双侧CCA，造成全脑缺血。
1.1.5 Levine低氧性缺血模型 结扎大鼠一侧CCA，次日将大鼠放入逐渐降低的低氧环境中，历时45分钟，结果引起脑蛋白质灰质和海马损伤[5]。
1.1.6 心脏猝停致全脑缺血模型 最常用的模型是通过心导管注射冷的氯化钾溶液导致心脏猝停，经过一定时间后，给予心肺复苏，就可造成暂时性全脑缺血模型。另一种方法为通过窒息导致心脏猝停。
1.2 沙土鼠全脑缺血模型 蒙古种沙土鼠缺少连接ICA和椎-基底动脉系统的后交通动脉，而在双侧大脑前动脉近端有近1/3也无衔接的血管，因此利用沙土鼠的这个独特的解剖特性，结扎双侧CCA即可造成全脑缺血模型。此模型手术简单，创伤小;缺点是沙土鼠体积小，生理反应不稳定，操作技术要求高[7]。
1.3 局灶性脑缺血模型
1.3.1 开颅机械闭塞大脑中动脉法 大脑中动脉(MCA)供血区是人类脑卒中的多发部位，闭塞大脑中动脉(MCAO)模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型，而造成MCAO的最直接方法即为开颅闭塞法。目前较常用的是经颞下入颅和经眼眶入颅。经颞下入颅是Tamura等首先使用，经眼眶入颅以O’Brien等的方法比较常用[8]。后来此模型又被广泛应用并进一步改良，如:电凝闭塞MCA所有可见分支，使梗死率大大提高;合并降低动脉血压以减少伴行血管对梗死区的血供，可扩大梗死面积等等。此模型的优点是直视下操作，梗死成功率较高，是目前梗死灶最为可靠、缺血效果最好、国际上应用最经典的MCA缺血模型;缺点是开颅创伤大，易感染，不可避免地引起脑脊液外流，并需要较高的外科手术技巧。
1.3.2 线栓法MCAO 1986年Koizumi等首次报道了不用开颅闭塞大鼠MCA的可逆性模型的制备方法，开创了MCAO模型的新途径，进而成为MCAO模型的经典方法[9]。1989年Zea Longa对该方法进行了改进，Traystman[10]在脑缺血动物模型综述中给予详尽介绍，即颈正中切口分离CCA、ECA和ICA，阻断CCA、ECA及其分支和ICA的分支PPA，从ECA或CCA插入尼龙线，经ICA到大脑前动脉，以阻断MCA发出处的血供。尼龙线的插入一般有两种方式：一种是从ECA残端插入至ICA颅内段，另一种是从CCA或ICA切口插入尼龙线。线栓法制作MCAO模型十分常用，很多学者在Longa的基础上进行了改进。何学令[11]用提线法阻断血流和在ECA上剪小口进行插线。龚彪等[12]采用预先在CCA、ICA套线，可以方便有效地控制出血。刘富东等[13]采用左侧颈部切口，这样手术视野暴露较好，并且认为不结扎PPA有利于防止ICA血栓形成。线栓法中栓线的制作与造模成功与否息息相关。目前大多数研究认为，采用直径0.25～0.30mm、置入长度自CCA分叉处(18.5±0.5)mm的栓线最为适宜。处理栓线的方法也有很多改进，如栓线用固体石蜡[14]、硅橡胶和多聚赖氨酸[15]、硝基漆[16]或指甲油[17]处理，或头端稍微加热、变粗[18]，这些方法均使其头端光滑圆钝，减少了刺破血管的机率，提高了成功率。总体看来，线栓法制备的MCAO模型已成为目前应用最广泛的局灶性脑缺血模型。该模型无需开颅，重复性较好，尤其是能准确控制缺血及再灌注时间;不足之处是插线入颅的操作过程系在非直视下进行，易诱发出血及血管痉挛等并发症，血流阻断与否无法直接判断，影响模型成功率。
1.3.3 栓塞法MCAO 手术分离CCA、ECA，微动脉夹暂时关闭CCA，由ECA注入栓子后将ECA结扎，开放CCA，使栓子自ICA进入MCA而建立MCAO模型。栓子制作是该模型成功与否的关键。碳素颗粒、空气、石蜡、树脂微粒等都曾作为栓子从ICA注入到MCA主干及分支引起MCA供血区缺血，其中以血凝块最为常用[19]。现在有很多改进方法，如向大鼠MCA注入聚乙烯硅氧烷[20]、十二酸酯钠[21]、经ICA注入真丝线段[22]或利用大鼠自体血栓结合线栓法[23]均可成功制备MCAO模型。栓塞法的优点是不需要开颅，制作简单，缺血效果可靠;缺点是由于栓子的随机性，无法预测栓塞的部位和大小。
1.3.4 血栓法 从CCA插管处将凝血酶注入ICA，复制出MCAO模型。该方法简便，但栓塞部位不恒定。
1.3.5 光化学法 通过大鼠尾静脉注射光敏染料如玫瑰红，暴露颅骨用特定波长(560nm)的光照射后可形成血栓，使血管阻塞。此模型最大优点为可在任何需要的皮层部位产生脑梗死，手术操作简单，动物可长期存活;其缺点为显著的微血管损伤。
1.3.6 FeCl3化学诱导法 开颅暴露一段MCA，将吸有50 %FeCl3溶液的小片定量滤纸贴于该段血管上并保留30分钟，术后24小时形成由血小板、红细胞和纤维蛋白构成的混合血栓。本模型为抗血栓药的筛选研究提供了较好的途径，缺点是需开颅手术及不能再灌注。
1.3.7 内皮素(ET-1)刺激法 由内皮细胞产生的ET-1是迄今为止发现的作用最强的血管收缩活性物质。有人将定向导管预先置于MCA处，然后在无麻醉的情况下经定向导管向MCA管腔周围灌注微量ET-1，从而在清醒的SD大鼠上成功复制出MCAO模型。该方法在清醒动物身上复制脑缺血模型，便于观察缺血即刻出现的神经功能变化;不足之处为存在开颅带来的弊端。
1.3.8 CCA加压夹闭法 Nishimura等[24]取沙土鼠做颈正中切口，暴露并分离CCA，以400g力将CCA夹于一副未完全切断的聚乙烯管之间持续2分钟，减压后5分钟内加压处有白色血栓形成。
1.3.9 负电流电解损伤法 应用机械收缩器使CCA血流减少，将不绝缘负电极在25号皮针引导下穿入血管，并使负电极与一个双道方波产生器的正极相连接，持续30分钟，电流直接损伤血管内皮细胞，引发血栓形成，阻塞血管腔，使脑血流量减少造成脑缺血。
1.3.10 机械压迫皮质梗死法 Watanabe等[25]结扎大鼠一侧CCA后，用圆柱形黄铜压迫对应皮质的硬脑膜，成功建立了皮质梗死模型。
此外，王世民等[26]认为椎-基底动脉系统的缺血占ICVD的一半或更高，于是用将大鼠两侧基底动脉凝闭，制作了很好的大鼠脑干缺血模型。
2 模型制备的影响因素
2.1 动物的选择
2.1.1 体重 在线栓法制备的MCAO的模型中，多数人认为该模型的最佳体重范围为280～350g的大鼠[12-14]，超出此范围的大鼠则不适宜进行模型的制备。
2.1.2 性别 因雌激素对脑损伤有保护作用，所以不可雌雄动物混用，目前多选择雄性动物[5，13，18]。
2.1.3 年龄 尽管脑梗死多发于老年人群，但由于老年大鼠的CCA、MCA等动脉发生了不同程度的迂曲、粥样硬化、管腔狭窄等解剖及病理上的改变，致使造模效果很差。故选用壮年大鼠制备模型，成功率较高[7，18]。
2.1.4 品系 最常用的是Wistar大鼠和SD大鼠[5，13，18]。
2.2 麻醉 全身麻醉直接或间接地影响血流、颅内压、脑代谢、神经递质的传递，甚至破坏细胞膜的结构，所以麻醉剂的选择尤为重要。常用的麻醉药中，苯巴比妥钠对体温和呼吸的影响最大，水合氯醛和乌拉坦次之，戊巴比妥钠相对较小。目前国际通行的气体麻醉剂是氟烷(halothane)。Theodorsson等[27]观察到通过气管插管和氟烷混合气体麻醉可明显减少实验大鼠的死亡。
2.3 梗死时间 大鼠脑缺血后梗死体积与时间相关性进行研究发现，梗死体积的渐趋扩大与时间有显著相关性。
2.4 体温 实验中温度过高或过低均会影响神经细胞损伤。一般将动物的体温维持在37 ℃，并在温度传感器涂上润滑膏或凡士林，插入直肠记录身体深部体温的变化[11，16，18]。
2.5 血压和血气 血压对脑梗死模型有一定影响，高血压的动物缺血改变出现早，而全身低血压也会加重脑损伤，因此实验应常规监测平均动脉压以供参考;还应对血气进行监控，通常给动物进行颈动脉或股动脉置管进行监测[5，7]。
2.6 血糖 脑缺血时动物血糖轻度升高，而高血糖本身就可使脑梗死的面积明显增加。为了控制动物血糖水平，在实验前禁食12～24小时，但不禁水[12，16]。还有学者使用胰岛素调节大鼠血糖水平以缩小脑梗死体积[28]。
此外，有报道说脑血流量小可加重脑缺血损伤，因此应用激光多谱勒血流仪监测脑血流量是必需的[5，16]。
3 评价指标
3.1 神经功能缺损评分 MCAO一般多采用改良Longa评分，评分标准为，0分：无神经功能缺损症状;1分：不能伸展对侧前爪;2分：身体向对侧转圈;3分：身体向对侧倾倒;4分：意识丧失，不能自发行走。神经功能缺损是评价局灶性脑缺血以及缺血性脑损害最重要的终末指标之一[12-14，29]。
3.2 脑电图改变 局灶性脑缺血会引起脑电波的抑制，缺血区脑电图出现波幅降低，频率减慢。因此，可利用脑电图仪，通过对脑电监测来判断阻塞成功与否[29]。
3.3 脑血流测定 在缺血后脑血流很快下降。在局部缺血时，测定脑血流的改变十分重要。最常用激光多谱勒血流仪进行监测[16，26，29]。
3.4 CT灌注成像 功能CT灌注成像是评价急性脑局部缺血模型的一种准确、敏感的方法。CT灌注成像在脑缺血的早期即可显示脑血流异常区域，灵敏度很高[16]。
3.5 磁共振成像 该技术提供了一种非创伤性研究脑的解剖、生理及生化改变的新手段，是一种确定缺血早期改变的敏感的检测方法[29]。
3.6 水迷宫测试 应用Morris水迷宫对动物进行定向航行试验，由测试软件记录大鼠在池中找寻平台的各项指标。是用以评价大鼠学习记忆能力的指标[30]。
3.7 TTC染色 TTC(氯化三苯基四氮唑)染色是评价脑缺血损伤的金指标，有助于脑梗死体积的测定。染色后正常组织呈白色，梗死组织呈红色。结合图像分析技术观测梗死范围，通过测量梗死体积来衡量脑缺血的严重程度[12，14，16，23，29]。
3.8 组织病理学观察
3.8.1 光镜观察 光学显微镜与染色技术相结合可观察到脑缺血后脑组织病变区域间质疏松，神经细胞肿胀明显、变形、轮廓不清，胞浆深染，胞核固缩，核周体消失，有神经细胞自溶及坏死等一系列病理形态变化，从而对缺血损害作出评价[12，16，23，29]。
3.8.2 电镜观察 电子显微镜的应用使形态学研究进入了超微水平，HE染色后光镜下可见到神经细胞核染色浓缩、聚集、周边化，线粒体肿胀，嵴减少或消失呈空泡状，内质网池扩张变形等结构改变，并且随缺血时间延长，突触结构异常，突触密度下降[16，29]。
3.9 脑组织含水量测定 用以观察脑缺血损伤后脑组织水肿情况。用天平称取脑组织湿重后放入干燥箱中干燥，24小时后称取干重。脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100 %[23]。
3.10 脑代谢测定 脑缺血后乳酸很快升高，随之出现ATP及磷酸肌酸下降、自由脂肪酸积累及其他一些代谢改变，代谢改变与缺血程度平行。
3.11 基因方面 随着对脑缺血研究的深入，很多研究人员发现很多基因在脑缺血的发生发展过程中起了重要的作用。如用免疫组化法可以研究Bcl-2、Bax、核转录因子(NF-KB)、P53蛋白、JNK、p-JNK、Bim、Na+-K+-ATP酶活性、TGF-β1等在脑缺血过程中的变化;用原位杂交技术观察Caspase-3和Caspase-9基因表达在介导细胞凋亡过程中的重要作用。
3.12 其他 有学者在评定局灶性脑缺血时，动物的体重下降可作为评价脑缺血模型成功的一个辅助指标[31]。
综上所述，在脑缺血动物模型的制备过程中，还应根据各模型的特点，结合具体条件，在综合考虑效益、成本等因素的前提下选择恰当、灵敏的监测指标和评价方法，避免人力、物力的浪费，从而提高实验效率和研究水平。
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