【关键词】 原发性血小板增多症（ET）；JAK2；基因；突变
1 对象和方法
1.1 对象研究
BCR/ABL阴性的原发性血小板增多症（ET）患者20（男14，女6）例，年龄10~77岁. 选正常健康人5名作为正常对照组. ET诊断参照PVSG和WHO制定的标准.
1.2 方法
① 基因组DNA制备： 抽取患者骨髓或外周血5 mL，常规分离白细胞，用QIAamp DNA mini kit 按说明提取白细胞基因组DNA. DNA的终浓度为100~200 mg/L. ② PCR扩增：参考Baxter等［1］方法进行引物设计和PCR检测. ③ 琼脂糖凝胶电泳：产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后紫外光透视仪分析图像并照相. ④ 基因测序：对所有阳性标本和阴性标本均再次分别在与上述相同的反应体系和条件下，进行PCR反应. PCR扩增产物经过纯化后，由上海生工生物公司进行测序，将所得到的测序结果与野生型基因序列进行对比.
2 结果
经过等位基因特异PCR检测发现JAK2 V617F突变阳性标本有203 bp和364 bp两条条带，而阴性标本只有一条364 bp条带. 20例ET中有9例（45.0%）存在JAK2 V617F突变，另11例则无JAK2 V617F突变，5例健康正常人为阴性（图1）. 等位基因特异性PCR检测所发现的阳性标本和所有的阴性标本均进行基因测序. 测序结果显示阳性标本为突变T峰，而阴性标本则为G峰. 测序结果与等位基因特异性PCR检测的结果相一致（图2）.
3 讨论
我们研究显示ET中JAK2 V617F基因点突变的阳性率为45.0%，表明JAK2突变体的抑制剂很可能在治疗有JAK2 V617F基因突变的MPD疾病中能起重要的作用. Baxter等［1］应用等位基因特异PCR检测发现ET中的阳性率高达57%(29/51)，明显高于其应用一般序列分析方法的12%（6/51）. 由于部分骨髓增殖性疾病患者中只有一部分外周血粒细胞可能起源于恶性祖细胞，同时普通方法仅可在超过40%的细胞（等位基因&>20%）有杂合子突变时才可重复检测到，因此普通测序可能会低估携带JAK2 V617F突变的比例. 应用等位基因特异PCR方法则可以在3%的细胞有杂合子突变就可检测到，可见其敏感性明显提高［1］.
Campbell等［2］发现JAK2 V617F阳性与阴性ET之间的最大差别在于血细胞计数和骨髓组织学的改变，JAK2 V617F阳性ET患者Hb增高、中性粒细胞增高、骨髓中红系和粒系造血增高、Epo明显降低、并且易发生静脉血栓，与PV患者相一致；而JAK2 V617F阴性ET患者更多地表现为单纯的血小板增多，可以说JAK2 V617F阳性的ET是PV一个连续的过程，而不是两个独立的疾病；或者说PV和ET实际上是一种疾病过程中的两种类型［3］.
【
参考文献
】1 对象和方法
1.1 对象研究
BCR/ABL阴性的原发性血小板增多症（ET）患者20（男14，女6）例，年龄10~77岁. 选正常健康人5名作为正常对照组. ET诊断参照PVSG和WHO制定的标准. 1.2 方法
① 基因组DNA制备： 抽取患者骨髓或外周血5 mL，常规分离白细胞，用QIAamp DNA mini kit 按说明提取白细胞基因组DNA. DNA的终浓度为100~200 mg/L. ② PCR扩增：参考Baxter等［1］方法进行引物设计和PCR检测. ③ 琼脂糖凝胶电泳：产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后紫外光透视仪分析图像并照相. ④ 基因测序：对所有阳性标本和阴性标本均再次分别在与上述相同的反应体系和条件下，进行PCR反应. PCR扩增产物经过纯化后，由上海生工生物公司进行测序，将所得到的测序结果与野生型基因序列进行对比.
2 结果
经过等位基因特异PCR检测发现JAK2 V617F突变阳性标本有203 bp和364 bp两条条带，而阴性标本只有一条364 bp条带. 20例ET中有9例（45.0%）存在JAK2 V617F突变，另11例则无JAK2 V617F突变，5例健康正常人为阴性（图1）. 等位基因特异性PCR检测所发现的阳性标本和所有的阴性标本均进行基因测序. 测序结果显示阳性标本为突变T峰，而阴性标本则为G峰. 测序结果与等位基因特异性PCR检测的结果相一致（图2）.
3 讨论
我们研究显示ET中JAK2 V617F基因点突变的阳性率为45.0%，表明JAK2突变体的抑制剂很可能在治疗有JAK2 V617F基因突变的MPD疾病中能起重要的作用. Baxter等［1］应用等位基因特异PCR检测发现ET中的阳性率高达57%(29/51)，明显高于其应用一般序列分析方法的12%（6/51）. 由于部分骨髓增殖性疾病患者中只有一部分外周血粒细胞可能起源于恶性祖细胞，同时普通方法仅可在超过40%的细胞（等位基因&>20%）有杂合子突变时才可重复检测到，因此普通测序可能会低估携带JAK2 V617F突变的比例. 应用等位基因特异PCR方法则可以在3%的细胞有杂合子突变就可检测到，可见其敏感性明显提高［1］.
Campbell等［2］发现JAK2 V617F阳性与阴性ET之间的最大差别在于血细胞计数和骨髓组织学的改变，JAK2 V617F阳性ET患者Hb增高、中性粒细胞增高、骨髓中红系和粒系造血增高、Epo明显降低、并且易发生静脉血栓，与PV患者相一致；而JAK2 V617F阴性ET患者更多地表现为单纯的血小板增多，可以说JAK2 V617F阳性的ET是PV一个连续的过程，而不是两个独立的疾病；或者说PV和ET实际上是一种疾病过程中的两种类型［3］.