【关键词】 大鼠心肌细胞
Fura-2的化学名为2-［6-双乙酸基-5-(2-双乙酸氨基)-5-甲苯氧乙氧基］-2-苯骈呋喃基-5-恶唑羧酸五钾盐。属于第二代荧光指示剂，是测定细胞内游离钙的重要试剂［1］。用Ca2+荧光指示剂Fura-2检测活细胞胞浆中［Ca2+］i是十几年来兴起的一门技术，已广泛应用于细胞生理、病理的研究，已有文献报道应用于测定细胞［2］、组织块［3］等内的游离钙。应用本院的970CRT荧光分光光度计，根据本院的实验条件，本研究建立了用Fura-2双波长荧光法测定心肌细胞内游离钙的方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 970CRT荧光分光光度计（上海分析仪器总厂），IGO150型CO2培养箱（Thermo electron corporation），601超级恒温水浴孵箱（江苏省金坛市医疗仪器厂），TDZ5-WS小型离心机（北京光学仪器厂）。
Fura-2/AM、DMEM、1∶250胰蛋白酶购于SIGMA公司；TritonX-100、EDTA购于上海华美；小牛血清购于北京元亨圣马生物技术研究所；其它试剂均为国产分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 实验原理 Fura-2具有较强的亲水性，不易透过细胞膜，但能与Ca2+特异性结合，在特定波长的紫外光激发下产生荧光，乙酰羧基甲基酯（Acetoxy-Methylester，AM）具有亲酯性，可透过细胞膜进入细胞。细胞质中的酯酶可将Fura-2/AM水解为游离的Fura-2，Fura-2与细胞内游离的Ca2+结合形成Fura-2-Ca2+复合物，Fura-2及其与Ca2+结合的复合物其最大激发波长分别为380nm和340nm，其发射光的强度与Ca2+浓度呈比例，胞浆Ca2+浓度愈高，Fura-2与Ca2+形成的螯合物愈多，在340nm激发波长处产生的荧光（F340）愈强，而在380nm激发波长处产生的荧光（F380）愈弱，因此F340/F380可以反映胞浆Ca2+浓度。
1.2.2 心肌细胞悬液的制备 取出生2～3天的SD大鼠，开胸取出心脏，用Hanks液洗涤3次后，剪成1mm3的小块，放入50mL三角烧瓶，加入0.08%胰蛋白酶消化液5mL，在磁力搅拌器上（35～37℃）进行消化，10min后取下吹打混匀后静置，吸弃上清，再加入5mL胰蛋白酶消化液，同样温度消化5～8min后取下静置，收集上清于离心管，并向管中加入少量DMEM培养基及小牛血清终止消化。重复以上过程4～6次，直至将组织块消化，细胞分离完全，以128g离心8～10min，吸弃上清液，加入15%小牛血清的DMEM培养基（含庆大霉素4万U/L）混悬沉淀的细胞，以200钼钢网过滤后置入CO2培养箱，37℃静置培养1.5～2h，以差速贴壁法纯化心肌细胞。将细胞密度调至2×106个/mL，0.4%台盼兰染色，活细胞比率大于90%，接种于含无菌载玻片的24孔培养板中，送入通以5%CO2的CO2孵箱中培养，培养24～36h。
1.2.3 Fura-2/AM的负载 去除长有心肌细胞的载玻片孔内的培养基，加入0.25%Fura-2/AM使其终浓度为5μmol/L，含0.2%小牛血清的培养基200μl，CO2孵育箱中37℃孵育40min，负载完毕后，将细胞用胰酶消化下来，离心10min（100g/min），去上清，用Hanks液冲洗2～3次，除去细胞外的Fura-2/AM，重新悬浮成1×106个/mL细胞浓度待用。
1.2.4 测定细胞悬液的荧光 荧光测定采用970CRT荧光分光光度计，测定条件：激发狹缝与发射狹缝均为10nm，灵敏度为2，扫描速度为最快。（1）先扫描测定fura-2/AM标准液、负载液及测定细胞内fura-2的激发光谱和发射光谱，fura-2/AM无Ca2+结合能力，其激发波长和发射波长在加入Ca2+前后变化不大，最大发射波长为490nm，最大激发波长为380nm，负载液的荧光光谱基本上同于此。Fura-2与细胞内游离的Ca2+结合形成Fura-2-Ca2+复合物，最大激发波长从380nm漂移到340nm。固定发射波长490nm，测定激发波长340/380nm的荧光值。（2）加入10%TritonX-100，使终浓度为0.1%，破坏细胞膜，半小时后上机检测最大值，检测340nm、380nm两个波长处的值。（3）加入EDTA，使终浓度为5mmol/L，络合所有的钙离子，使fura-2呈游离状态，半小时后上机检测最小值，检测340nm、380nm两个波长处的值。
1.2.5 钙离子浓度的计算 上面测得的是相对值，由下列公式计算［Ca2+］i，［Ca2+］i=Kd（FD/FS）×（R-Rmin/Rmax-R）。式中R是实验观察到的荧光比值（F340/F380），Kd是fura-2与Ca2+反应的解离常数，生理条件下为224nmol/L，Rmax是fura-2全部为Ca2+饱和时的荧光比值，Rmin是fura-2完全未结合Ca2+时的荧光比值，FD和FS分别代表无Ca2+和Ca2+饱和状态下380nm处的荧光强度。细胞自身荧光测定同上，唯不加入fura-2/AM。在计算R之前应减去未负载fura-2的细胞的自发荧光。
2 结果与讨论
荧光分光光度计测得静息期大鼠心肌培养细胞的［Ca2+］i为(98.8±7.6)nmol/L，这与文献报道相一致。扫描记录见图。图1中，fura-2负载前通过激发光谱扫描测定其最大激发波长为380nm。图2中，Fura-2与细胞内游离的Ca2+结合形成Fura-2-Ca2+复合物，最大激发波长从380nm漂移到340nm。图3中，通过对fura-2进行发射光谱扫描，测定其最大发射波长为490nm。
fura-2作为新一代荧光探针具有荧光强度高、选择性强、双波长激发等无可比拟的优点。由于fura-2与Ca2+结合后的最大激发波长有较大的漂移（从380nm移至340nm），用这两个光谱的荧光比值作为指标，不仅能提高观察的信号，而且可基本不受细胞密度及荧光剂浓度的影响，能更好地校正胞浆的钙离子浓度，这也正是单波长测定法所无法达到的。
赵艳.大鼠心肌细胞内游离钙的Fura-2荧光测定辽宁医学院学报 2007年6月，28(3)实验过程中有一些影响因素需要注意。（1）fura-2/AM与细胞负载完后必须把残留的fura-2/AM洗涤干净，否则残留fura-2/AM将产生荧光，影响测试结果。（2）测量过程中要注意淬灭剂（卤素盐、氧化剂、去垢剂、重金属离子）对荧光的干扰。本实验用水均采用超纯水以除去淬灭剂对荧光的影响。（3）fura-2的光漂白。因荧光探剂的光漂白可引起严重基线漂移，高张氧能使光漂白更严重，可通过减短样品光照时间、狭缝宽度和减低氧水平，将影响减至最低限度。（4）pH值的影响。荧光素发光的最有利条件是离子状态，pH值可影响荧光剂的离子化程度，进而影响其发光效果，生理情况下pH值的变化对fura-2的荧光光谱影响不大。
用荧光探剂（fura-2）测定细胞内游离钙浓度的方法简便易行，不需要大型仪器设备的支持，并且结果重复性好，是一种值得推广的定量测量方法。
参考文献
［1］ 张均田，李锡明，石成璋，等.用Fura-2/AM测定细胞内游离Ca2+浓度的方法.中国药学杂志，1991，26：655.
［2］ Michael.Alpha-Adrenergic Stimulation and Cytoplasmic Free Calciunm Concentration in Cultured Remal Proximal Tubular Cell:Evidence for Compartmentalization of Quin-2 and Fura-2［J］.JCell Physiol，1986，128:466.
［3］ Sato K，Ozaki H.Changes in Cytosolic Calcium Level in Vascular Smooth Muscle Strip Measured Stimultaneously with Contraction Using Fluorescent Calcium Labocator Fura-2［J］.J Phamacol Exp Ther，1988，246:294.