【摘要】 目的 探讨逐淤化痰汤对脑出血大鼠血肿周围脑组织细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。方法 90只SD大鼠随机分为逐淤化痰汤组、脑出血组和假手术组，每组30只。用尾状核注射自体血法建立脑出血模型；在不同时间点以Hoechst法检测神经细胞凋亡数及免疫组化法检测Bcl-2、Bax蛋白表达的变化。结果 出血组脑组织细胞凋亡数和Bcl-2、Bax蛋白表达水平均明显高于假手术组（P＜0.01）；与出血组相比，逐淤化痰汤组细胞凋亡数与Bax蛋白表达水平均下降（P＜0.05或P＜0.01），而Bcl-2蛋白表达水平显著增高（P＜0.05或P＜0.01）。结论 逐淤化痰汤可抑制出血后神经细胞凋亡，此作用可能与其上调Bcl-2和下调Bax蛋白表达水平有关。
【关键词】 逐淤化痰汤 脑出血 细胞凋亡 Bcl-2蛋白 Bax蛋白
Abstract: Objective To probe into the effect of edaravone on the cell apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax protein following intracerebral hemorrhage(ICH) in rats， and explore the protective effect of edaravone on the cerebral injury induced by hemorrhage. Methods Ninety SD rats were randomly pided into 3 groups: Zhuyuhuatan oral liquid group， ICH group and sham group(n=30).The rat model of ICH was established by injection of autologous blood into the caudate nucleus. At different time separately neuronal apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax protein were monitored by Hoechst and immunohistochemistry，respectively. Results Apoptosis and the expression of Bcl-2 and Bax protein were significantly increased in the ICH group as compared with the sham group(P＜0.01). Treatment of Zhuyuhuatan oral liquid markedly reduced apoptosis ahd the expression of Bax protein in comparison to the ICH group(P＜0.05 or ＜0.01)，while the expression of Bcl-2 was obviously higher in the Zhuyuhuatan oral liquid group than that in the ICH group(P＜0.05 or P＜0.01). Conclusions Zhuyuhuatan oral liquid inhibits the neuronal apoptosis following intracerebral hemorrhage which might be relative to the alleviated oxidative stress， up regulated Bcl-2 protein and down regulated expression of Bax protein.
Key words:Zhuyuhuatan oral liquid; cerebral hemorrhage; apoptosis; Bcl-2 protein; Bax protein
脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是神经系统常见病和多发病。研究表明，细胞凋亡机制参与了脑出血继发性神经细胞损伤［1，2］。现阶段中药方剂在脑出血的治疗中仍然发挥着重要作用，但传统观念认为有引起出血加重危险，故多应用于脑出血恢复期。最新研究表明，脑出血急性期应用逐淤化痰药物疗效更好［3］。逐淤化痰汤（Zhuyuhuatan oral liquid）治疗脑出血疗效确切，一般用于脑出血恢复期。本实验观察大鼠脑出血急性期应用逐淤化痰汤后血肿周围脑组织内细胞凋亡及Bcl-2（B细胞淋巴瘤/白血病-2）、Bax蛋白的表达情况，为逐淤化痰汤治疗急性期脑出血提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
健康雄性SD大鼠共90只，体重200～300 g，3～4月龄，（由辽宁医学院实验动物中心提供）。
1.1.2 药品和试剂
逐淤化痰汤（钩藤、生大黄各15 g，水蛭、三七、郁金各10 g，红参12 g，丹参20 g）由锦州医药公司购进，取液250 mL按1∶1浓度水煎，于辽宁医学院中药制剂室制成含生药1 g/mL，冰箱冷藏备用。Bcl-2，Bax测定试剂盒（购自武汉博士德公司），细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒（购自碧云天生物技术研究所）
1.1.3 主要实验仪器
立体定位仪：（美国STOELTING公司），微量进样器（上海安亨微量进样器厂）。
1.2 实验方法
1.2.1 分组及给药
随机分为假手术组、脑出血模型（ICH）组及逐淤化痰汤治疗组，每组30只。每组又分为术后1、2、3、5、7d，5个时间点，每个时间点各6只。逐淤化痰汤治疗组于造模后6 h开始灌喂给药，用量为每次1 g/kg，2次/日（用量相当于70 kg人相同体表面积用量的3 倍）。脑出血组：造模后1 d开始灌喂等量生理盐水，2次/日。假手术组：除不注入自体血外，其余条件同ICH组。
1.2.2 脑出血模型的制备
参照Xue［4］和Yang［5］方法将大鼠称重后给予10%水合氯醛（3.3 mL/kg）腹腔注射麻醉，大鼠俯卧位，头部固定在脑立体定位仪上。脑立体定位仪定位大鼠右侧尾状核（前囟后0.2 mm，矢状缝向右旁开3.0 mm，深度6.0 mm）［6］；切开顶部中线皮肤，以前囟后0.2 mm，中线右侧旁开3 mm处，在颅骨表面钻孔，将微量注射器调整至钻孔处。取血前将鼠尾放在40 ℃温水中5 min，消毒后距末端0.5 cm处剪断，让鼠尾血自然滴下取血，用微量注射器取大鼠自体不凝血50 μL，在立体定位仪引导下向尾状核注入自体不凝血；缓慢进针6 mm，以25 μL/min速度2 min内注入50 μL血液；留针10 min，缓慢出针，用骨蜡封闭颅骨上的钻孔，缝合皮肤。以上均按无菌操作原则进行。假手术组除不注血外，其余操作同ICH组。
1.2.3 取材
各组大鼠分别按实验设计于造模后1、2、3、5、7d取材。每组动物每个时间点各取2只大鼠麻醉处死后迅速打开胸腔，暴露心脏，剪开右心房，于心尖部剪开左心室，插管至主动脉，快速注100 mL生理盐水冲洗后，再以4%多聚甲醛灌注固定，断头取血肿周围直径5 mm厚脑组织，以4%多聚甲醛固定24 h。常规脱水、透明、石蜡包埋、连续冠状切片，切片厚度5 um，切片贴附于预处理的载玻片上，用前脱蜡至水，行细胞凋亡检测、Bcl-2与Bax蛋白免疫组化染色。
1.2.4 指标测定
在高倍物镜下， 每张切片中随机选取出血灶边缘相互不重叠的5个视野，计数高倍（400×）镜下细胞凋亡、Bcl-2和Bax蛋白的阳性细胞数。
1.2.4.1 细胞凋亡检测
采用细胞凋亡-Hoechst［7，8］ ，具体操作步骤按试剂盒说明书进行，试剂由碧云天生物技术研究所提供。荧光显微镜下正常细胞呈正常蓝色，而凋亡细胞为细胞核呈致密浓染，或呈碎快状致密浓染，颜色有些发白。
1.2.4.2 Bcl-2及Bax蛋白检测
采用免疫组化SP法，具体操作步骤按试剂盒说明书进行，鼠抗Bcl-2和Bax多克隆抗体，工作浓度分别为1∶100和1∶75，均为公司武汉博士德公司产品。Bcl-2和Bax蛋白以细胞胞质呈棕黄色着色为阳性细胞。
1.2.5 数据处理
实验数据用±s表示，组间比较均采用方差分析及q检验。全部统计学处理采用SPSS13.0统计分析软件完成。
2 结果
2.1 细胞凋亡
假手术组凋亡细胞在各时间点均有少量表达，ICH组凋亡细胞第1 天开始明显增多，第2天达到高峰，之后逐渐减少，第7天仍有凋亡细胞存在，逐淤化痰汤组与ICH组比较凋亡细胞数各时间点均有显著降低(P&<0.05或 P&<0.01)。
2.2 Bcl-2与Bax蛋白表达的变化
在假手术组Bcl-2与Bax蛋白表达阳性细胞数较低；ICH组与假手术组相比，Bcl-2、Bax蛋白表达阳性细胞数均明显增加（P&<0.05）；与ICH组比较，逐淤化痰汤组Bcl-2蛋白表达阳性细胞数显著增加(P&<0.05)，Bax蛋白表达阳性细胞数显著降低(P&<0.05)，见表1。表1 各组大鼠在不同时间点Hoechst阳性细胞、Bcl-2、Bax蛋白表达（略）注：与出血组比较*P＜0.05，**P＜0.01
3 讨论
细胞凋亡是不同于细胞坏死的一种细胞死亡形式，其过程受一系列相关基因的调控。其中Bcl-2家族在凋亡调控基因中位于重要地位，Bcl-2蛋白是一种膜合蛋白，为中枢神经系统主要的神经保护性蛋白，它存在于细胞的线粒体、核膜等处，主要生理功能抑制细胞凋亡、延长细胞寿命；通过阻止细胞凋亡的早期环节而发挥作用，能够阻止或降低染色质浓缩和DNA裂解的发生，它的表达是抑制细胞凋亡的关键步骤；Bax蛋白是Bcl-2的同源蛋白，具有促进细胞凋亡的作用，并具有抑制Bcl-2的效应。在正常细胞中存在着Bax与Bcl-2微量表达，细胞胞浆中Bax- Bax同源二聚体可促进细胞凋亡，Bcl-2- Bax异源二聚体则抑制细胞凋亡，细胞是否发生凋亡，依赖于这些分子的相对浓度。Bax/Bcl-2比值增大促进凋亡，而Bax/Bcl-2比值减小抑制凋亡。
本实验结果显示：ICH组Bcl-2、Bax蛋白表达均比较高，这可能是出血过程中损伤和抗损伤作用相互拮抗的一种表现，Bcl-2受到某种抑制因素的作用，使Bax促凋亡作用最终占优势而导致细胞凋亡。而在逐淤化痰汤组Bcl-2蛋白表达显著增加，Bax蛋白表达显著降低，说明逐淤化痰汤有上调Bcl-2和下调Bax蛋白表达的作用，并因此而减少脑出血后神经细胞凋亡的发生。研究表明，脑出血后细胞凋亡的高峰在48～72 h，这种高峰与临床上病情的继发性加重的过程一致，故认为凋亡可能是脑出血后血肿周围神经细胞迟发性损伤的重要机制。
综上所述，逐淤化痰汤作为中药制剂在脑出血急性期应用具有上调Bcl-2、下调Bax蛋白表达以减少细胞凋亡的作用。本实验再次证明实验性脑出血大鼠在脑出血急性期应用活血化淤中药是安全、有效的，为今后临床上在脑出血急性期应用活血化淤中药提供实验依据。
参考文献
［1］Matsushita K， Meng w， Wang X， et al. Evidence for apoptosis after intra cerebral hemorrhage in rat striatum ［J］. J Cereb Blood Flow Metab， 2000，20:396-404.
［2］Gong C， Boulis N， Qian J， et al.Intracerebral hemorrhage induced euronal death ［J］. Neurosurgery，2001，48:875-883.
［3］李如奎，谭宏.活血化瘀法治疗高血压脑出血的进展［J］.浙江西医结合">中西医结合杂志，2000，10（9）：513.
［4］Xue M， DelBigioM R. Intracerebral in jection of autologous whole blood in rats: time course of inflammation and cell death［J］.Neuroscience Letters， 2000， 283: 230.
［5］Yang G Y， Betz A L， Chenevert TL， et al. Experimental intracerebral hemorrhage: relationship between brain edema， blood flow， and blood-brain barrier permeability in rats［J］. J Neurosurg， 1994， 81: 93.
［6］包新明，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱［M］.北京：人民卫生出版社， 1991：1.
［7］Zhu Chunlei，Zhang Chaodong，Wang Yunjie.The study of apoptosis induced by methylene blue(MB) on C6 cell and MB enhances BCNU therapy of experimental rat C6 glioma［J］.Zhongliu，2004，24(1):21-24.
［8］Yao G， Ling J， Ye D，et al. Nonylphenol induces apoptosis of Jurkat cells by a caspase-8 dependent mechanism ［J］. Immunopharmacol， 2007，7(4):444-453.