【摘要】 目的 研究辛伐他汀对h3O2诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用并探讨其机制。方法 应用出生2～3 d的SD（Sprague-Dawley）大鼠乳鼠心肌细胞进行培养，用h3O2建立心肌细胞凋亡模型。随机分为五组：正常组，损伤组，1 μmol/L，3 μmol/L，10 μmol/L辛伐他汀保护组。损伤组h3O20.2 mmol/L作用6 h。甲基四唑蓝比色法（MTT法）测定心肌细胞活力；ＰＩ－ＡＶ双染后，流式细胞分析仪测定细胞凋亡率；用Western blot法测定caspase-3蛋白含量。结果 (1)h3O2能明显造成心肌细胞损伤:损伤组与正常组相比细胞活力下降。辛伐他汀1 μmol/L，3 μmol/L，10 μmol/L保护组对损伤心肌细胞有不同程度的保护作用(P&<0.05)，并随剂量增加效果明显；（2）流式细胞仪检测细胞凋亡率损伤组比正常组增高(P&<0.05)；辛伐他汀各保护组细胞凋亡率均比损伤组降低(P&<0.05)，并随剂量增加效果明显；（3）用Western blot法测定caspase-3蛋白含量显示，损伤组比正常组caspase-3含量明显增加，辛伐他汀保护组可以降低h3O2引起的caspase-3蛋白含量增加，并随剂量增加效果明显。结论 辛伐他汀能够减轻h3O2引起的培养心肌细胞的凋亡，可能与抑制细胞内凋亡相关蛋白caspase-3有关。
【关键词】 辛伐他汀 心肌细胞 细胞凋亡 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 过氧化氢
Abstract：Objective To investigate the protective effect and mechanism of simvastatin on cultured cardiomyocytes apoptosis by h3O2. Methods About 2～3 days old Sprague-Dawley rat neonatal cardiac myocytes were cultured， the cultured cells were pided into five groups， namely control group， damage group(h3O2 0.2 mmol/L)， damage+1 mol/L simvastatin group， damage+3 mol/L simvastatin group， and damage+10 mol/L simvastatin group. The activity of dehydrogenase in mito-chondria was detected by MTT assay. Apoptosis rates of the cells were analyzed by flow cytometry. Expression of caspase-3 of cardiomyocytes were determined by Western blotting.Results (1) h3O2 could induce injury on cultured cardiac myocyte. This was evident in the descent of cell livability detected by MTT. (2)The rate of cell apoptosis of control group was 6.64%， the injury group was 24.28%， and different concentrations of simvastatin (1 mol/L，3 mol/L，10 mol/L) groups were 18.83%， 12.39%， 8.93%（P&<0.01）.(3)Compared with the damage group expression of caspase-3， the simvastatin(1 mol/L，3 mol/L，10 mol/L) groups were much lower. Conclusions The results showed that simvastatin decreased the apoptosis of cardiomyocytes induced by h3O2， and the protective effect may be related to caspase-3.
Key words：simvastatin; cardiomyocyte; apoptosis; caspase-3; h3O2
在心肌疾病中凋亡机制已越来越引起人们的重视，目前在心肌缺氧、缺血性疾病，心肌梗塞，心功能衰竭晚期等患者中都发现有心肌细胞凋亡发生［1］，而这些病理过程都伴有氧化应激。其中活性氧自由基（oxygen free radical，OFR）对心脏的损伤被广泛重视，近期研究认为自由基导致的细胞凋亡是心肌受损的主要途径。氧自由基直接参与细胞凋亡已在不同种类的细胞中得到证实［2］，而且凋亡可以被抗氧化剂所抑制。h3O2是一种强氧化剂，可以用它来诱导心肌细胞的凋亡。他汀类药物(statins)是目前世界上首选的调节血脂的药物，它是羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)抑制剂。辛伐他汀用于临床的最初目的是用来降低血脂，但是近来越来越多的研究发现辛伐他汀对心血管系统的保护作用不仅与降脂作用有关，而且还存在许多与降脂作用无关的其他机制，包括改善内皮细胞功能的紊乱，提高内皮源性一氧化氮合成酶(eNOS)的生物活性，抑制平滑肌细胞的增生，抗氧化作用，抗炎作用，逆转血管重构。本实验拟观察辛伐他汀对h3O2诱导的大鼠培养心肌细胞凋亡模型的影响，并初步探讨其机制。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 Sprague-Dawley新生大鼠(1～3 d)，雌雄不限（由辽宁医学院动物中心提供）。
1.1.2 药品和试剂
DMEM培养基、胰酶：Gibco公司；小牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；细胞凋亡检测试剂盒：北京宝赛试剂生物技术有限公司；24孔培养板：美国BD公司；Caspase-3抗体：北京中杉金桥生物技术有限公司；辛伐他汀：Sigma公司。实验时在55 ℃温水浴中，将辛伐他汀溶于0.5 mL无水乙醇中，加入0.1 mol/L的NaOH 0.5 mL作用2 h。室温放置30 min使其成为钠盐。用HCl调pH7.2，用蒸馏水稀释为2 mmol/L，过滤。放入-20 ℃冰箱储存。 其余试剂为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 原代新生大鼠心肌细胞培养
在无菌的条件下，取出生1～3 d的SD大鼠乳鼠，开胸取出心脏，用D-Hanks液冲洗3次后剪成约1 mm3大小的碎块，加入0.08%胰蛋白酶消化细胞，取消化完毕后的细胞，加入含15%小牛血清的DMEM培养基，及0.01的双抗液（含1×105 U/L青霉素，100 μg/mL链霉素）的培养基，吹打均匀后以1×109/L的密度接种于底面积25 mm2培养瓶，或0.5×109/L的密度接种于24孔培养板送入通以体积分数为5%CO2及95%空气的二氧化碳孵箱中培养［3］。
1.2.2 实验分组
常规培养心肌细胞48 h后，换液。为了减少血清中的成分对实验结果的影响，换液时更换含0.04%小牛血清的培养基。将每组用5个底面积为25 cm2的培养瓶，或者将一个24孔培养板分为5组。分组如下：（1）对照组：正常对照组；（2）h3O2损伤组：正常组＋h3O2 0.2 mmol/L；（3）辛伐他汀保护组：在损伤组的基础上分别加入辛伐他汀浓度为1 μmol/L，3 μmol/L，10 μmol/L。
作用时间：损伤组加入h3O2 0.2 mmol/L作用6 h;各保护组提前加入相应剂量辛伐他汀作用1 h，加入h3O2 0.2 mmol/L作用6 h。
1.2.3 培养心肌细胞活力的测定
原代培养心肌细胞，将细胞密度调至1×104 /mL，接种于96孔培养板，每6孔细胞一组，各组分别加入对应的干预药物作用。于测试前4 h，每孔加入2 mg/mL的MTT液（50 μL/孔）；于CO2孵箱中继续培养4 h后弃去培养液，每孔加入DMSO 0.15 mL，振荡10 min后，酶标仪检测各孔OD值（检测波长570 nm）。
1.2.4 PI／膜联蛋白V染色［4］
将接种于培养瓶的心肌细胞，48 h换液，加药同上，加入终浓度为0.2 mmol/L的h3O2孵育6 h(正常组除外)，0.125%的胰酶消化细胞，吸弃胰酶，PBS轻轻吹成悬液，1 000 r/min离心10 min洗3次，200 μL Binding buffer，用Annexin-V-FITC（10 μL） / PI（5μL）双标记后做流式细胞仪分析。
1.2.5 caspase-3蛋白检测
采用免疫印迹法检测caspase-3蛋白，6孔板培养细胞用蛋白裂解液裂解、超声破碎，取上清液，变性。上样前测量样品中总蛋白含量，以8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜，封闭后，加入一抗，稀释度为1∶1 000，4 ℃孵育过夜。二抗稀释度1∶500，用碱性磷酸酶试剂盒显色，结果经扫描输入计算机进行分析。
1.2.6 统计学处理
所有数据均以均数±标准差(±s)表示， 统计学处理采用F及q检验。
2 实验结果
2.1 辛伐他汀对h3O2损伤心肌细胞活力（OD值）的影响
结果显示损伤组心肌细胞OD值比正常对照组明显降低；不同剂量辛伐他汀给药组的心肌细胞OD值比损伤组有不同程度的升高，组间差异显著（P&<0.05）。OD值能间接反应细胞活力，因此说明h3O2能造成心肌细胞活力下降，不同浓度辛伐他汀能使损伤的心肌细胞活力增加，且有明显剂量依赖性（P&<0.05），见表 1。表1 辛伐他汀对h3O2损伤心肌细胞活力的影响（略）注：n=8，与正常组相比**P&<0.01，与损伤组相比#P&<0.05， ##P&<0.01
2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率
0.2 mmol/L h3O2作用于心肌细胞6 h 后，凋亡率明显增加，与损伤组比较，辛伐他汀能够降低心肌细胞凋亡率(P&<0.05)，并且有明显的剂量依赖性，见表 2，图1。表2 辛伐他汀对h3O2损伤心肌细胞凋亡率的影响（略）注：n=6，与正常组相比**P&<0.01，与损伤组相比#P&<0.05，##P&<0.01a : 正常组， b:损伤组，c、d、e : 辛伐他汀1 μmol/L， 3 μmol/L， 10 μmol/L group
2.3 caspasce-3蛋白检测
Western blot结果显示，正常细胞胞质中仅存在pro-caspase-3的表达，经h3O2作用6 h后的细胞胞质中不仅存在pro-caspase-3表达，还存在活化型caspase-3表达。辛伐他汀各保护组pro-caspase-3和活化型caspase-3表达均较损伤组减轻，并且呈剂量依赖，见图2。
3 讨论
细胞凋亡在个体正常发育成熟、维持机体内环境稳定和正常生理功能以及多种疾病的发生、发展的病理生理过程中具有很重要的生物学意义。细胞凋亡在心血管疾病中的研究目前仍处于起步阶段，伴随分子心脏病学研究的进展，有证据表明心肌缺血和再灌注可导致心肌细胞死亡，凋亡在其中发挥了重要的作用［3］73-76。
急性心肌梗塞时，大量心肌坏死出现在心肌细胞凋亡之后，因此认为心肌细胞凋亡是急性心肌梗塞引起细胞损害的主要方式，而坏死是继细胞凋亡之后梗塞区细胞进一步丧失的主要原因。
过去对凋亡研究的注意力集中在细胞凋亡时DNA被酶切降解为寡核苷酸片段的现象上，近来则关注凋亡中一个更早的过程即一系列细胞内具关键作用的蛋白质被特异性酶解的过程，半胱天冬酶类(caspase)涉及这一过程。
在caspase介导的凋亡信号转导通路包括死亡受体通路、线粒体通路和内质网通路，caspase-3是各凋亡通路下游进行底物酶解的共同的关键蛋白酶，作为凋亡的效应因子被称为凋亡的“执行者”［4］1-16。在正常活细胞中，Caspase以前体pro-caspase-3酶原(32 kD)形式存在于胞质中，在细胞凋亡早期阶段，pro-caspase-3被快速活化为caspase-3，活化的caspase-3由两个大亚基(17 kD)和两个小亚基(12 kD)组成，裂解相应的胞质胞核底物，最终导致细胞凋亡。其作用主要包括:（1）消化破坏细胞内多种蛋白酶复合体；（2）激活核内核酸酶，如激活DNA片段因子45等，造成DNA 裂解破坏形成DNA片段［5］ ；（3）通过特异地消化ATPase 4b亚基，破坏细胞的钙泵功能，造成细胞内钙超载。上述作用的综合结果造成细胞不可逆性损伤，形成凋亡。
本实验中，我们观察了辛伐他汀对h3O2作用下心肌细胞凋亡的影响。并观察其抑制凋亡作用的途径。研究结果表明，在一定浓度的h3O2作用下，培养心肌细胞中caspase-3表达与心肌细胞凋亡率明显增加。辛伐他汀能够剂量依赖性地抑制h3O2诱导培养心肌细胞凋亡的作用，与其改善h3O2造成的培养心肌细胞中caspase-3蛋白的表达变化有关。因此，可以推断辛伐他汀抑制培养心肌细胞凋亡与它影响caspase-3的功能有关，辛伐他汀能够通过抑制培养心肌细胞内活化caspase-3的表达以减轻h3O2对细胞的凋亡作用。
参考文献
［1］Tanaka M，Ito H，Adachi S，et al.Hypoxia induces apoptosis with enhanced of Fas antigen messenger RNA in cultured neonatal rat cardiocyte ［J］.Circ Res，2004，75(3):426-433.
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［3］李莹辉，丁柏，汪恭质，等.药物对模拟失重条件下心肌细胞功能的保护作用［J］.中华航空航天医学杂志，1999，10（2）：73-76.
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