【摘要】 目的 探讨睾丸固定术对隐睾大鼠生殖细胞发育与凋亡的影响。方法 22日龄 SD 雄性大鼠复制左侧隐睾模型。实验随机分为假手术组、隐睾组和隐睾固定术组，每组10 只。建立左侧隐睾模型，隐睾固定术组于建立左侧隐睾模型后14 d行隐睾下降固定术。以生物素-dUTP/ 酶标亲和素测定法检测睾丸生殖细胞凋亡数目，用免疫组化SABC法检测eNOS 基因表达。结果 与假手术组相比，隐睾组和隐睾固定术组隐睾侧睾丸发生生精细胞凋亡的数目显著增加（P＜0.01）。与隐睾组相比，睾丸固定术后生殖细胞凋亡明显减少（P＜0.01）。隐睾组睾丸退化的生精细胞胞浆中eNOS 基因表达明显增强。结论 隐睾大鼠生殖细胞凋亡增多，睾丸固定术可降低生精细胞的凋亡水平。eNOS表达与生精细胞凋亡有密切关系。
【关键词】 隐睾症 睾丸固定术 eNOS 基因
Abstract：Objective This thesis aims to explore the effect of orchidopexy on germ cell development and apoptosis in rat model.Methods Thirty male SD rats(22-day old)were randomly pided into three groups: left- sham-operated group(n=10)，cryptorchid group(n=10)，orchidopexy group(n=10).Rats were rendered unilaterallycryptorchid， and 14 days later， orchidopexy was performed on a subset of these rats. Forty days after the initial procedure， testes were harvested for immunohistochemical studies. Apoptosis was detected by in situ 39-end-labeling of DNA with digoxigenin-dUTP， and eNOS protein was detected using an eNOS monoclonal antibody.Results The number of apoptotic germ cell in cryptorchid testes increased observably compared with the left-sham-operated group (P&<0.01)， and the number of apoptotic germ cell in orchidopexid testes decreased observably compared with cryptorchid testes (P&<0.01). Conclusions Cryptorchidism increases germ cell apoptosis， and orchidopexy can lower the level of germ cell apoptosis. eNOS expression is closely related to germ cell degeneration.
Key words：cryptorchidism; orchidopexy; eNOS; gene
隐睾是男性不育症的重要原因之一。睾丸局部温度升高可导致生精细胞过度凋亡并成为不育的主要原因。隐睾睾丸生精上皮各类细胞(包括各级生精细胞、支持细胞、间质细胞)中以生精细胞对温度最为敏感［1］，而激素、温度等都是生精细胞凋亡的重要调节因素，但是这些细胞外的调节因素，必须激活生精细胞内部某些基因的转录，表达才能诱导细胞凋亡［2］。本实验旨在研究大鼠隐睾固定对生殖细胞发育和凋亡的影响，并探讨eNOS基因表达与生殖细胞发育和凋亡的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组 SD雄性大鼠（22日龄）30只随机分为3组：正常对照组10例、隐睾组10例、隐睾固定组10例，由辽宁医学院实验动物中心提供。
1.2 动物模型建立 隐睾组：水合氯醛麻醉，下腹正中切口，切断左侧睾丸引带，用7～0无创伤线将睾丸固定于后腹壁上。对照组：方法同上（但不切断睾丸引带）将睾丸处理后立即将睾丸还至阴囊。隐睾固定组：隐睾模型术后14 d，下腹正中切口和阴囊横行切口将睾丸游离后还至阴囊，用7～0无创伤线将睾丸固定于阴囊肉膜上。在第一次手术后第40 d用快速脱颈椎法处死所有模型动物，留取双侧睾丸标本，用电子天平称重。）
1.3 生物素-dUTP/酶标亲和素测定法检测细胞凋亡 阴性对照用PBS液代替DNA末端转移酶（试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司），凋亡细胞的胞核呈棕褐色。结果测定：细胞核出现棕黄色或棕褐色者为TUNEL染色阳性，判为凋亡细胞。每个标本计数50个生精小管截面中凋亡细胞，计算每个生精小管截面的平均凋亡细胞数。
1.4 免疫组化 SABC法检测eNOS基因表达，eNOS多抗和免疫组化SABC试剂盒购自武汉博士德生物技术公司，阴性对照组用PBS液代替一抗，阳性细胞胞浆呈棕黄色。
1.5 统计学方法 数据以±s表示，用SPSS13.0分析软件进行方差分析及两两比较分析。
2 结 果
2.1 睾丸的重量的变化 见表1。假手术组和对侧睾丸的平均重量无明显差别。与假手术组相比，隐睾组隐睾侧睾丸的重量显著减轻。隐睾固定组睾丸的平均重量较隐睾组显著增加(P﹤0.01)。
2.2 生殖细胞凋亡的影响 与假手术组相比，隐睾组睾丸生殖细胞凋亡明显增加(P﹤0.01)。与隐睾组相比，隐睾固定组生殖细胞凋亡明显减少(P﹤0.01)，但仍略高于假手术组(P﹥0.05)。
2.3 eNOS 在睾丸生殖细胞中的表达 在睾丸生精上皮的各级生精细胞、支持细胞和间质细胞胞浆中均存在eNOS 基因的弱表达，免疫染色呈淡黄色;在隐睾组睾丸退化的生精细胞胞浆中eNOS 基因表达明显增强，免疫染色呈深棕黄色。表1 左侧睾丸重量及TUNEL计数例数重量