作者：张蔚， 谭艳芳， 江山*， 陈茗， 梁瑞韵， 吕志强
【摘要】 【目的】 探讨长效β2受体激动剂福莫特罗对哮喘(支气管哮喘)小鼠气道杯状细胞增生及粘蛋白MUC5ac mRNA表达的影响。【方法】 40只雌性SPF级BABL/c小鼠，随机分为4组，每组10只。A组为生理盐水对照组;B组为卵蛋白(ovalbumin，OVA)哮喘组;C组为哮喘福莫特罗干预组;D组为哮喘地塞米松干预组。在末次激发24 h后所有小鼠取左肺组织行过碘酸雪夫(PAS)染色，采用医学图像分析软件测定支气管上皮杯状细胞面积占上皮细胞总面积的百分比并计算杯状细胞数量。取右肺组织行real-time qRT-PCR，检测粘蛋白MUC5ac mRNA的表达。【结果】 B组小鼠支气管上皮杯状细胞的数量、杯状细胞占上皮细胞总面积的百分比和MUC5ac mRNA水平显著高于A组[(163.63 ± 16.68)个vs (0.46 ± 0.16)个，(77.36 ± 5.05)% vs (0.03 ± 0.01)%，(10.31 ± 0.73) vs ( 1.00 ± 0.13)，P均 &< 0.05];C组小鼠支气管上皮杯状细胞的数量、杯状细胞占上皮细胞总面积的百分比和MUC5ac mRNA水平均低于B组[(52.04 ± 4.60)个 vs (163.63 ± 16.68)个，(30.05 ± 3.72)% vs (77.36 ± 5.05)%，(1.64 ± 0.14) vs (10.31 ± 0.73)，P均 &< 0.05] ;D组小鼠支气管上皮杯状细胞的数量、杯状细胞占上皮细胞总面积的百分比和MUC5ac mRNA水平均低于B组[(63.41 ± 6.39)个 vs (163.63 ± 16.68)个，(38.52 ± 3.83)% vs(77.36 ± 5.05)%，(1.72 ± 0.10) vs (10.31 ± 0.73)，P均 &< 0.05];C组和D组的杯状细胞数量、面积百分比和MUC5ac mRNA水平间差异均无统计学意义[(52.04 ± 4.60)个 vs (63.41 ± 6.39)个，(30.05 ± 3.72)% vs (38.52 ± 3.83)%，(1.64 ± 0.14 ) vs (1.72 ± 0.10)，P均 &> 0.05]。【结论】 长效β2受体激动剂福莫特罗可抑制哮喘小鼠气道杯状细胞增生及粘蛋白MUC5ac mRNA的表达。
【关键词】 哮喘; 福莫特罗; 杯状细胞; MUC5ac mRNA; 小鼠
Abstract： 【Objective】 To investigate the effect of long-acting β2-adrenoceptor agonist formoterol on airway goblet cell hyperplasia and protein MUC5ac mRNA expression in asthmatic mice. 【Methods】 Forty female BABL/c mice were randomly pided into four groups with 10 mice in each. Mice in group A were treated with saline as control， and mice in group B， group C， and group D were sensitized by OVA to establish asthmatic model， but group C were pretreated with formoterol and group D were pretreated with dexamethasone. All mice were killed 24 hours after the final OVA challenged. The left lung tissue sections were stained with periodic acid Schiff (PAS) for identification of goblet cell hyperplasia. The right lung was isolated for detecting MUC5ac mRNA by the method of real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (real-time qRT-PCR). 【Results】 The number of the goblet cell， the percentage of goblet cell to total cell and the expression of MUC5ac mRNA in group B were significant higher than those of group A [(163.63 ± 16.68) vs (0.46 ± 0.16)， (77.36 ± 5.05)% vs (0.03 ± 0.01)%， (10.31 ± 0.73) vs (1.00 ± 0.13)， P &< 0.05]. The number of the goblet cell， the percentage of goblet cell to total cell 气道粘液高分泌是支气管哮喘(简称哮喘)气道重要的病理生理改变，也是导致哮喘高发病率和致死率的重要因素之一[1]。气道上皮的杯状细胞是粘液产生和分泌的主要细胞，其增生肥大不仅是哮喘气道重构的一部分[2]，且杯状细胞脱颗粒释放粘蛋白的程度更可能是导致哮喘恶化的机制之一[3]。粘液的主要成分是粘液素，其中粘蛋白MUC5ac主要存在于哮喘气道，其基因的转录和表达水平在哮喘时明显上调[4]。本研究通过检测小鼠哮喘模型经腹腔注射长效β2受体激动剂福莫特罗后气道杯状细胞数量和粘蛋白MUC5ac mRNA的转录水平的变化，探讨福莫特罗对哮喘气道粘液分泌的影响。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 实验动物
雌性SPF级BABL/c纯系小鼠40只，鼠龄6 ～ 8周，体质量16 ～ 20 g，购自中山大学实验动物中心，合格证号： 广东省实验动物检测所合格2007A045号。所有小鼠饲养于中山大学实验动物中心，SPF级实验室。
1.1.2 主要试剂
OVA(V级、纯度 &> 98%，美国Sigma公司);福莫特罗(阿斯利康制药有限公司);氢氧化铝(广州化学试剂厂);荧光定量试剂盒(QuantiTect SYBR Green RT-PCR kit)。
1.1.3 设 备
雾化器(boy037G6000型，德国Pari公司)、凝胶电泳槽(美国Bio-Rad公司)、荧光定量分析仪(FTC-2000A)、image-pro plus6.0图像分析软件(美国MediaCybernetics公司)、Nikon TE2000-U倒置显微镜(日本 尼康公司)。
1.2 方 法
1.2.1 哮喘模型的建立
40只小鼠按随机数字表法随机分为生理盐水对照组(A组)、哮喘组(B组)、福莫特罗干预组(C组)和地塞米松干预组(D组)共4组，每组10只。哮喘组(B组)、福莫特罗干预组(C组)和地塞米松干预组(D组)均在第1和第14天分别腹腔注射0.2 mL致敏液(OVA 10 μg + 氢氧化铝20 μg)进行致敏，从第21天起将小鼠置于约0.5 m × 0.5 m × 0.5 m大小的雾化吸入箱中进行激发，通过超声雾化器雾化吸入2.5% OVA溶液5 mL，每次30 min，每周3次，连续6周。福莫特罗干预组(C组)于每次雾化激发哮喘前10 min腹腔注射福莫特罗1 mg/kg，地塞米松干预组(D组)在每次雾化激发哮喘前30 min腹腔注射地塞米松0.5 mg/kg。生理盐水对照组(A组)以生理盐水代替OVA溶液腹腔注射致敏和雾化吸入激发。
1.2.2 标本收集
末次雾化吸入24 h后，以10 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，结扎右肺主支气管，远端切断支气管后取右肺组织置于液氮罐中保存以备抽提mRNA。1 mL注射器注入左主支气管，以20 cmh3O (1 cmh3O = 0.098 kPa)压力灌注40 g/L的多聚甲醛-磷酸盐缓冲液入左肺，切取左肺并浸泡于40 g/L多聚甲醛-磷酸缓冲液中24 h。
1.2.3 气道上皮杯状细胞计数
肺组织40 g/L多聚甲醛-磷酸缓冲液固定后，常规脱水包埋，行过碘酸-雪夫(PAS)染色。每只小鼠随机选5张肺组织切片，每张切片以单盲法随机选取横断面较圆、直径100 μm的支气管5支进行观察，采用image-pro plus6.0图像分析软件测量每张切片支气管上皮中被染成紫红色的杯状细胞的面积，以其占所在支气管上皮总细胞面积的百分比表示，并计算杯状细胞数量。
1.2.4 real-time PCR检测肺组织粘蛋白MUC5ac mRNA 的表达水平
引物由上海吉玛生物工程公司设计并合成。MUC5ac引物序列：上游引物：5′-ACCACTTTCTCCTTCTCCACAC-3′，下游引物：5′-AACAGGGCTCTTCACAGACAATA-3′产物长度：150 bp;18s mRNA为内参照物。取液氮保存的肺组织，Trizol一步法提取总RNA，再采用M-MLV逆转录试剂盒合成第一链cDNA，置-20 ℃冰箱备用。采用SYBR Green荧光染料法经预变性、变性、退火、延伸和再延伸等共反应40个循环，整个过程收集荧光。使各组内每样本与内参18s mRNA扩增效率相同，采用2-△△Ct法[5]计算样本的原始拷贝数，分别扩增MUC5ac mRNA和18s mRNA，每样本作3复孔。利用相应软件获得各组样本与内参18S mRNA相对应的扩增曲线，计算样本Ct值(即在PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数)、△Ct值(同一样本中，待检基因与内参基因平均Ct值的差值)和△△Ct值(其余样品的△Ct值和对照样本相应基因的△Ct值之差)，最终得出2-△△Ct值(相对于参考因子基因表达的倍数)以获得四组间MUC5ac mRNA的相对定量比较，即以A组(生理盐水对照组)为参照，其余各组的MUC5ac mRNA相对表达量用参照组的2-△△Ct倍表示，并绘制相应柱状图。
1.3 统计学处理
所有数据以 x ± s 表示，数据运用SPSS 13.0统计软件处理，各组计量数据采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用LSD法。P &< 0.05为差异有统计学意义。两变量的相关分析采用等级Pearson相关法。
2 结 果
2.1 气道上皮杯状细胞增生情况分析
观察PAS染色病理片，4组小鼠气道上皮被染为紫红色的杯状细胞数量存在差别(图1)。图像分析结果显示A组与B组、C组和D组杯状细胞数量比较差异有统计学意义(t = 163.17、51.58、62.96，P &< 0.05);C组和D组显著低于B组，差异有统计学意义(t = 111.59、100.22，P &< 0.05);C组和D组比较差异无统计学意义(t = 1.32，P &> 0.05);杯状细胞面积占上皮细胞总面积百分比LSD-t检验显示：A组与B组、C组和D组比较差异有统计学意义(t = 77.33、30.02、38.50，P &< 0.05);C组和D组显著低于B组，差异有统计学意义(t = 47.31、38.84，P &< 0.05);C组和D组比较差异无统计学意义(t = 0.47，P &> 0.05;表1)。
2.2 肺组织的MUC5ac mRNA的转录水平
利用相应软件分别获得各组样本与内参18S mRNA相对应的扩增曲线(图2)，以生理盐水对照组(A组)为定标，分别计算得生理盐水组(A组)、哮喘组(B组)、福莫特罗干预组(C组)和地塞米松干预组(D组)的Ct值、△Ct值和△△Ct值，最后算出2-△△Ct值(表2)。统计学分析B、C、D组的MUC5ac mRNA水平均高于A组，差异有统计学意义(t值分别为9.31、0.65，0.72，P &< 0.05);B组的转录水平高于C、D组，差异有统计学意义(t = 8.66、8.60，P &< 0.05);C、D组的转录水平比较差异无统计学意义(t = 0.07，P &> 0.05)。绘制相应柱状图(图3)。
2.3 相关性分析
粘蛋白MUC5ac mRNA的表达水平与支气管杯状细胞数量成正相关(r = 0.878;P &< 0.01)。
3 讨 论
气道粘液的高分泌性是哮喘重要的病理生理特征之一，不仅可导致气道的阻塞，使呼吸道感染难以控制，而且是导致哮喘恶化、致死性哮喘发生的主要原因[6]。研究表明杯状细胞与气道粘液的分泌有关，是气道粘液主要的产生和分泌细胞[7]。哮喘时气道上皮杯状细胞数量增多，体积增大，发生明显的肥大改变，杯状细胞增生已构成哮喘气道重塑的一个重要方面[2]。本研究采用Temelkovski[8]经典方法建立小鼠哮喘模型，通过对气道上皮的病理染色后发现哮喘组(B组)小鼠气道杯状细胞面积占上皮细胞总面积的百分比及杯状细胞的数量与生理盐水对照组(A组)对比升高有显著性差异，与文献报道一致，存在杯状细胞增生的改变。
气道粘液的高分泌性还表现在黏蛋白的分泌增多，高分子糖基化的黏蛋白——粘液素(mucin，MUC)是影响气道粘液弹性和粘附性的最主要成分，其中粘液素MUC5ac蛋白是表达于成人呼吸道中的主要黏蛋白，且哮喘气道出现明显的杯状细胞增生的同时，肺组织中的MUC5ac蛋白和MUC5ac mRNA表达水平也明显升高，证明黏蛋白MUC5ac和MUC5ac mRNA的表达水平是哮喘气道杯状细胞增生和分泌亢进的主要标志。本实验结果表明，杯状细胞增生明显的哮喘组(B组)小鼠与生理盐水对照组(A组)比较，其肺组织MUC5ac mRNA的水平升高，具有统计学差异。同时，在杯状细胞与黏蛋白MUC5ac mRNA表达水平的关联性分析中两者呈正相关，证明了杯状细胞的增生与黏蛋白MUC5ac mRNA水平的表达存在联系，均与文献报道一致。由此可见，抑制杯状细胞增生和黏蛋白MUC5ac mRNA的表达可有效控制气道的高分泌性，对预防和治疗哮喘具有重要意义。
福莫特罗是一种常用的长效β2受体激动剂，具有选择性高、起效快、作用强、全身副作用小、安全性高等作用特点，已被证明能有效地预防和控制哮喘的发作。目前关于福莫特罗对哮喘气道作用机制方面多着重于其扩张支气管和抗炎作用等方面，而对于其是否对哮喘气道粘液的高分泌性有影响，即对哮喘气道杯状细胞增生和黏蛋白MUC5ac mRNA表达水平的作用的研究在国内外文献中尚未见报道，但Kaur等[12]研究表明福莫特罗可控制炎症基因的表达，Maneechotesuwan等[13]研究发现福莫特罗可降低哮喘患者痰中IL-8和中性粒细胞的数量，有效抑制炎症介质的释放;同时，Basbaum等[14]研究表明，多种炎症介质的释放均可诱发气道上皮杯状细胞的增生和黏蛋白基因表达水平的提高，因此福莫特罗对哮喘气道杯状细胞增生和黏蛋白基因表达有抑制作用在机制上存在可能。本研究通过腹腔注射福莫特罗的方法对哮喘小鼠进行干预，研究结果表明哮喘福莫特罗干预组(C组)小鼠气道的杯状细胞数量、杯状细胞占气道上皮总面积的百分比水平和肺组织MUC5ac mRNA水平均显著低于未干预的哮喘组(B组)小鼠，提示福莫特罗在降低哮喘小鼠的气道粘液分泌方面亦可发挥一定的作用，其作用机制仍有待进一步研究。地塞米松是一种常用的糖皮质激素，国内外研究[15-16]均证明其对哮喘气道的杯状细胞增生及MUC5ac mRNA的表达有抑制作用。本研究中地塞米松干预组(D组)小鼠在气道上皮杯状细胞的数量、杯状细胞占上皮细胞总面积的百分比和MUC5ac mRNA水平均显著低于哮喘组(B组)小鼠，与文献报道一致;福莫特罗干预组(C组)小鼠气道上皮杯状细胞的数量、杯状细胞占上皮细胞总面积的百分比和MUC5ac mRNA水平与地塞米松干预组(D组)对比无统计学差异，提示福莫特罗抑制哮喘小鼠气道杯状细胞增生和粘液素分泌的作用与地塞米松相似。对人类哮喘气道，福莫特罗是否具有类似作用尚需进一步研究。
参考文献
Evans CM， Koo JS. Airway mucus： The good， the bad， the sticky [J]. Pharmacol Ther， 2009， 121(3)：332-348.
Siddiqui S， Martin JG. Structural aspects of airway remodeling in asthma [J]. Curr Allergy Asthma Rep， 2008， 8(6)： 540-547.
Ordonez CL， Khashayar R， Wong HH， et al. Mild and moderate asthma is associated with airway goblet cell hyperplasia and abnormalities in mucin gene expression [J]. Am J Respir Crit Care Med， 2001， 163(2)： 517-523.
Evans CM， Kim K， Tuvim MJ， et al. Mucus hypersecretion in asthma： causes and effects [J]. Curr Opin Pulm Med， 2009， 15(1)： 4-11.
Kenneth J， Livak TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ct method [J]. Method， 2001， 25(9)： 402-408.
Hays SR， Fahy JV. The role of mucus in fatal asthma [J]. Am J Med， 2003， 115(1)： 68-69.
Ficker JH. Physiology and pathophysiology of bronchial secretion [J]. Pneumologie， 2008， 62 suppl 1： S11-13.
Temelkovski J， Hogan SP， Shephered DP， et al. An improved murine model of asthma： selective airway inflammation， epithelial lesions and increased methacholine responsiveness following chronic exposure to aerosolised allergen [J]. Thorax， 1998， 53(10)： 849-856.
Kirkham S， Sheehan JK， Knight D， et al. Heterogeneity of airways mucus： variations in the amounts and glycoforms of the major oligomeric mucins MUC5AC and MUC5B [J]. Biochem J， 2002， 361(pt 3)： 537-546.
Zuhdi Alimam M， Piazza FM， Selby DM， et al. Muc-5/5ac mucin messenger RNA and protein expression is a marker of goblet cell metaplasia in murine airways [J]. Am J Respir Cell Mol Biol， 2000， 22(3)： 253-260.
Menezes MB， Teixeira AL， Terra Filho J， et al. Inflammatory and functional effects of increasing asthma treatment with formoterol or double dose budesonide [J]. Respir Med， 2008， 102(10)： 1385-1391.
Kaur M， Holden NS， Wilson SM， et al. Effect of beta2-adrenoceptor agonists and other cAMP-elevating agents on inflammatory gene expression in human ASM cells： a role for protein kinase A [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2008， 295(3)： L505-514.
Maneechotesuwan K， Essilfie-Quaye S， Meah S， et al. Formoterol attenuates neutrophilic airway inflammation in asthma [J]. Chest， 2005， 128(4)： 1936-1942.
Basbaum C， Gallup M， Gum J， et al. Modification of mucin gene expression in the airways of rats exposed to sulfur dioxide [J]. Biorheology， 1990， 27(3-4)： 485-489.
刘剑波，张珍祥，徐永健，等. 激素对哮喘小鼠气道粘液分泌作用的研究 [J]. 中华医学杂志，2006，86(35)：2491-2494.
Chen Y， Nickola TJ， Difronzo NL， et al. Dexamethasone-mediated repression of MUC5AC gene expression in human lung epithelial cells [J]. Am J Respir Cell Mol Biol， 2006， 34(3)： 338-347.