作者：陈小燕，蔡振寨，满晓华，王伟忠，李兆申
【摘要】 目的?：观察迷走神经背核(dorsal motor nucleus，DMN)微量注射生长抑素(somatostatin，SS)对大鼠胰腺内神经元c-fos表达的影响。方法：取体质量250～300 g健康雄性SD大鼠12只，随机分为两组：实验组(n=6)DMN微量注射100 nL浓度为0.4μg/mL的SS，对照组(n=6)DMN微量注射100 nL的人工脑脊液(aCSF)。两组均予20%脂肪乳液行十二指肠灌注1 h后，取大鼠胰腺标本行c-fos的免疫组化染色。结果：DMN注射SS组大鼠胰腺内c-fos免疫阳性神经纤维阳性面积(6?122.5±1?410.0 vs 1?875.8±992.0)和阳性指数(0.62±0.02 vs 0.26±0.07)均明显降低(P?&<0.01)。讨论：DMN微量注射外源性SS对大鼠胰腺内神经元有显著的抑制效应，说明DMN外源性SS通过抑制胰腺内神经元发挥对胰腺外分泌的抑制作用。
【关键词】 迷走神经背核;生长抑素;胰腺内神经元;大鼠
Abstract: ? Objective: To observe the effect of microinjection of somatostatin?(SS)?into the vagal dorsal motor nucleus?(DMN)?on the expression of c-fos in intrapancreatic neurons. Methods:?Twelve SD rats，weighing 250～300 g，were randomly selected and pided into two groups:?the experimental group and the control one.100 nL SS?(0.4μg/mL)?was microinjected into the DMN in the experimental group(n=6)，while 100 nL artificial cerebrospinal fluid?(aCSF)?was microinjected into DMN in the control group(n=6). One hour after the intraduodenal perfusion of 20% intralipid in each group， the rats’pancreases were obtained and studied by immunohistochemistry (IHC) of c-fos. Results:?Both c-fos expression positive area and positive intensity of intrapancreatic positive-neurons in the experimental group’s pancreases were significantly decreased after microinjection of exogenous SS into the DMN compared with the control group (6?122.5±1?410.0 vs 1?875.8±992.0，0.62±0.02 vs 0.26±0.07，?respectively). Conclusion:?Microinjection of exogenous SS into the DMN obviously inhibites the activity of intrapancreatic neurons. These results indicate that exogenous SS of the dorsal motor nucleus has an obviously inhibitory effect on pancreatic exocrine secretion by inhibiting the activity of intrapancreatic neurons.
Key words: ?vagal dorsal motor nucleus;somatostatin;intrapancreatic neurons;rats
迷走神经背核(dorsal motor nucleus，DMN)是重要的内脏运动核团，参与胰腺外分泌功能的调节。研究表明，生长抑素(somatostatin，SS)不是直接通过迷走传入神经纤维和迷走传出神经纤维发挥抑制其胰腺外分泌功能的效应，而是在中枢发挥对胰腺外分泌功能的抑制作用[1]。侧脑室内微量注射SS对甲状腺素激素(thyrotropin-releasing hormone，TRH)刺激的胰腺外分泌有抑制作用，但是对基础胰液分泌没有抑制作用[2]。我们先前的研究证实，DMN微量注射外源性SS对大鼠胰腺基础外分泌具有抑制作用[3]。在本研究中，我们采用人工合成生长抑素八肽——善宁(Sandosta-tin)，来观察DMN微量注射生长抑素对大鼠胰腺内神经元活性的影响。
1??材料和方法
1.1??实验动物、仪器和试剂??健康雄性SD大鼠12只(上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，清洁级，体重250～300?g;立体定向仪、微操纵仪、微量注射仪(日本Narishige公司);善宁(瑞士诺华制药有限公司);2%旁安天蓝(PSB)，第二军医大学生理教研室王伟忠老师馈赠;直径0.7 mm的一次性使用intima-II静脉留置针(江苏碧迪医疗器械有限公司);兔抗c-fos多克隆抗体(Oncogen公司);EnvisionTM两步法免疫组化试剂盒(DAKO公司);BH-2、BX-50显微镜(Olympus公司);恒流泵HL-2B(上海市清浦沪西仪器厂);T7014 X 700线CCD彩色摄像机(美国)。
1.2??动物分组及实验步骤??健康雄性SD大鼠12只随机分为两组，对照组6只，实验组6只。其中实验组DMN微量注射SS，对照组DMN微量注射人工脑脊液(artificial cerebrospi-nal fluid，aCSF)，aCSF的配制采用Yamatomo配方[4]。实验前大鼠禁食过夜，自由饮水。以2%氯胺酮腹腔麻醉(60～80 mg/kg)，建立外分泌功能研究大鼠模型[5]。通过红外线烤灯使大鼠肛温维持在37 ℃左右，实验过程中每半小时追加一次1/3麻醉剂量的氯氨酮。将大鼠固定于立体定向仪上，用安尔碘消毒后颅部皮肤，切开颅顶至背部正中皮肤，去除部分枕骨和小脑，充分暴露延髓背面。琼脂生理盐水棉球将创面周围围成一池状，池中倒入温石蜡油。另用安尔碘消毒腹部皮肤后，沿腹正中切口开腹，暴露胃及十二指肠、胰腺，在幽门下5 mm和十二指肠、空肠交界处分别置直径2 mm的塑料管并固定待十二指肠灌注。动物稳定30 min后，将2根外径1.0 mm的细玻璃管拉制成尖端外径20～30μm的两管微量注射管，并分别灌入0.4μg/mL的善宁和aCSF，善宁溶于aCSF。两管微量注射管安装在注射用的微操纵仪上，通过微量注射仪注射药物，注射体积为100 nL，注射时间为30 s，注射后微量注射管停留在药物注射部位5 min。DMN的立体定位以延髓闩部(obex)为参考点，向前0.6～0.8 mm，旁开0.5～0.6 mm，深度0.5～0.6 mm。微量注射毕以恒流泵HL-2B按3 mL/h的速度向十二指肠内灌注20%脂肪乳液1 h。实验结束后将染料2% PSB 50 nL微量注射至药物注射部位。过量氯氨酮深度麻醉大鼠，经左心室-升主动脉插管，先灌注温生理盐水100～200 mL，先快后慢。再灌注0.1 mmol/L PBS配制的4%多聚甲醛(4 ℃)350～400 mL，先快后慢，约60～80 min。取胰腺标本冰冻切片。并去除颅骨，小心取出完整脑干并放入4 ℃ 4%多聚甲醛中后固定4 h，再移入含30%蔗糖的0.1 mmol/L PBS溶液中，4 ℃过夜储存沉底。再进行冰冻切片，将延髓作50μm的冠状切片，1%中性红染色，在显微镜下寻找染点，根据Paxinos and Watson图谱[6]，观察其在延髓中的分布。
1.3??胰腺内神经元免疫组化染色??胰腺标本行冰冻切片(16μm)，置入预冷4 ℃的丙酮固定30 min，室温自然干燥、复温，0.01 mol/L PBS洗3×10 min，置入含1.5% h3O2、20%甲醇、0.2% triton的PBS液室温孵育20 min，0.01 mol/L PBS洗3×10 min，置入含0.01 mol/L BSA、0.5% triton的PBS液室温孵育2 h，加c-fos一抗(1∶10?000)4 ℃孵育48 h，0.01 mol/L PBS洗3×10 min，加兔二抗(Envision试剂盒)37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗3×10 min，DAB显色2～3 min，苏木素衬染3～5 min，酸酒精分化30 s，流水冲洗、蓝化，自然风干，中性树脂封片，56 ℃烤箱过夜。阴性对照：PBS代替一抗、二抗。阳性对照：大鼠脑组织冰冻切片。
1.4??计算机图像分析??彩色病理图像分析软件采用IMS型计算机彩色图像分析综合系统，是华东理科大学自动化研究所和上海医科大学共同研制开发的产品。在Olympus光学显微镜下用IMS型计算机彩色图像分析综合系统在每张切片同一结构位置随机挑选5个视野(×200)，测量以下参数，每张切片测量3次取其均值：①阳性强度均值表示窗内免疫反应阳性强度均值，可以客观反映免疫阳性反应的强度。②阳性面积表示窗内阳性免疫反应面积，可以客观反映免疫反应阳性产物分布的数量。③阳性比率(%)=阳性反应面积/阴阳面积和×100%，可以客观反映阳性产物和阴性产物的相对比率。④阳性面积比(%)=阳性反应面积/测量面积×100%，可以客观反映免疫反应阳性产物面积占总测量面积的百分比。⑤阳性指数(positive index，PI)=阳性反应面积×阳性强度值/测量面积，是客观反映免疫反应阳性强度的总指标。
1.5??统计学处理方法??采用t检验。
2??结果
两组大鼠胰腺及胰岛组织内均有c-fos阳性神经纤维分布(见图1、图2)，但实验组和对照组比较，胰腺内c-fos免疫阳性神经纤维阳性强度均值、阳性面积、阳性比率、阳性面积比和阳性指数均明显降低，各参数的均值与对照组相比，差异有显著性(P?&<0.05)(见表1)。
3??讨论
胰腺外分泌功能是餐后食物消化吸收过程的重要组成部分，受神经和体液因素(主要为促胰液素与胆囊收缩素)的双重支配。在胰腺外分泌功能的体液调节因素中SS是最强的抑制胰液分泌的激素，其效应为剂量正相关性，它的作用机制目前尚不清楚。Li等[1]在SD大鼠的研究中发现，SS是在中枢发挥对胰腺外分泌功能的抑制作用。Masuda等[7]发现，侧脑室注射SS明显抑制胰腺的外分泌，该效应不能被迷走神经切断术、心得安(β受体阻滞剂)所阻断，但可以被α受体阻滞剂六烃季铵(hexamethonium)和酚妥拉明(phentolamine)所阻断。静脉给予SS模拟侧脑室注射后血液中的SS浓度对胰腺外分泌功能的抑制效应远不如前者，两者差异具有显著性。这个实验亦说明SS在中枢发挥对胰腺外分泌的抑制效应。中枢对胰腺分泌功能的调节主要是通过DMN发出的副交感运动神经起作用。免疫组化方法发现，在迷走神经复合体(dorsal vagal complex，DVC)中广泛分布SS阳性的神经元[8]。以往零星的研究发现，DMN微量注射TRH能刺激胰腺分泌[9]，而胰多肽(pancreatic polypeptide，PP)则能抑制胰腺分泌[10]。脑内注射SS、钙调基因相关肽(calcitonin gene-regulated peptide，CGRP)亦对胰腺分泌有抑制作用[1，11]。但各种中枢神经递质调节胰腺分泌的作用通路，它们对迷走传出神经功能的调节、对胰腺内神经元的调控，以及特定神经递质对胰腺分泌的特异性调节作用尚未见报道。DMN的迷走传出神经对胰腺分泌的调控是非常复杂的，其一方面接受孤束核(nucleus of the solitary tract，NTS)的传入信息，另一方面也接受高级中枢的控制[12]，此外，血循环中一些内分泌因素可通过血脑屏障薄弱处直接作用于DMN[13]。我们认为，DMN迷走传出神经对胰腺功能的调节是众多兴奋性神经递质与抑制性神经递质综合作用而间接发挥作用的，迷走神经传出纤维作用于胰腺内神经，后者综合各种中枢信息，调节胰腺功能。研究发现DMN迷走传出神经有多种神经递质，如乙酰胆碱、NOS及各种神经肽(VIP、NPY、GRP)等[14]，因此，我们推测特定的刺激可以作用于某一组迷走运动神经元，它们有特定的神经递质，这些传出纤维作用于具有不同的特有神经递质的胰腺内神经元，从而调控不同的胰腺功能。
我们先前的研究[3]表明，DMN微量注射外源性SS对单位时间内胰液基础分泌的体积和胰液蛋白质分泌量均有显著的抑制效应，其差异有显著性，证实DMN在胰腺外分泌功能的调节中发挥作用，外源性SS在DMN发挥对胰腺外分泌功能的抑制作用。还有研究发现[15]，DVC微量注射SS是通过生长抑素受体-2发挥其抑制胰腺外分泌的作用的。但其对胰腺内神经元活性影响的研究未见报道。为了探讨迷走神经背核SS对胰腺外分泌功能的调控及其机制，本研究采用临床常用的人工合成生长抑素八肽——善宁作为中枢微量注射的药物观察DMN微量注射SS对胰腺内神经元活性的影响，结果发现胰腺内c-fos免疫阳性神经纤维阳性强度均值、阳性面积、阳性比率、阳性面积比和阳性指数均明显减少。其结果一方面进一步证实DMN在胰腺外分泌功能的调节中发挥作用，另一方面也说明外源性SS在DMN发挥对胰腺内神经元的抑制作用，从而对胰腺外分泌功能发挥抑制作用。迷走神经节前纤维起源于迷走神经背核，到达胰腺内的神经节换元，节后纤维支配胰腺腺泡细胞和胰腺导管细胞，大部分节后纤维末梢释放Ach，通过M受体加强胰腺外分泌功能。一部分节后纤维是非胆碱能非肾上腺素能的，有的释放兴奋性递质，有的释放抑制性递质。迷走神经背核SS的抑制胰腺外分泌功能的效应可能是通过抑制胰腺内迷走兴奋性纤维所致。由此我们认为，DMN微量注射SS引起的抑制胰腺外分泌功能的效应可能是SS抑制了迷走神经背核中的胆碱能神经元，使迷走神经兴奋性传出冲动减少，胰腺内神经元的兴奋性冲动减少，出现抑制效应。本研究进一步证实迷走神经背核注射外源性SS抑制胰腺内神经元的活性，从而发挥对胰腺外分泌功能的抑制作用。
进一步研究可使用神经元活性示踪物质c-fos的免疫组织化学方法观察DMN微量注射SS后胰腺内胆碱能神经元和各种肽能神经元活性改变，进一步深入了解胰腺外分泌的神经内分泌调节机制。
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