作者：季敬璋，白永恒，俞雅萍，莫亚林，吕建新
【摘要】 目的 ：探讨雌激素受体α基因PvuII和XbaI位点的单核苷酸多态性与良性前列腺增生（BPH）发病风险的关系。方法：收集112例BPH患者和111例健康对照人群的外周血标本，应用PCR-RFLP技术分析雌激素受体α基因PvuII和XbaI的单核苷酸变异，采用非条件logistic回归分析和计算其基因型和等位基因频率。结果：PvuII和XbaI位点基因型符合Hardy-Weinberg平衡检验；PvuII位点以杂合子基因型Pp占多数（占44.84%），基因型PP最少（占14.35%）；XbaI位点以纯合子基因型xx为主，为64.13%；XX最少，为4.48%；比较PvuII和XbaI位点的基因型和等位基因在BPH患者和健康对照中的分布频率，差异均无显著性（P &>0.05）；雌激素受体α基因PvuII与XbaI位点间具有较强的连锁不平衡效应（D’=0.958，r2=0.398）。单体型分析显示pX在BPH患者中的分布显著高于健康对照人群（P=0.032108，OR=6.394，95%CI：0.919～44.517），提示单体型pX是BPH发生的易感因素。结论：雌激素受体α基因的单核苷酸多态性与前列腺增生发病存在一定的相关性。
【关键词】 雌激素受体α基因 多态性 限制性片段长度多态性分析 良性前列腺增生
Abstract: Objective: To investigate and explore the relationship between estrogen receptor α (ESRα) gene polymorphisms and the susceptibility of benign prostatic hypertrophy (BPH). Methods: The polymorphisms of ESRα gene were genotyped by PCR-RFLP in 112 BPH patients and 111 healthy male controls. The genotype and allelic frequencies were calculated and analyzed with unconditional logistic regression. Results: The frequency distribution of PvuII and XbaI genotypes accorded with the Hardy-Weinberg equilibrium test (P &>0.05). The frequency of PvuII heterozygous genotype ‘Pp’was for 44.84% and‘PP’for 14.35% ；the frequency of XbaI homozygous genotype‘xx’and‘XX’ was for 64.3% and 4.48%，respectively. There was no significant difference in the genotype and allelic frequencies of PvuII and XbaI in the BPH cases compared with healthy controls，but significant difference for haplotype pX (P =0.032108， OR=6.394，95%CI:0.919～44.517)，suggesting haplotype pX might be a risk factor of BPH. Conclusion: The polymorphisms of mononucleotide of estrogen receptor α gene may be associated with the morbidity BPH.
Key words: estrogen receptor α；polymorphism；PFLP; benign prostatic hypertrophy
性前列腺增生(benign prostatic hyper-plasia，BPH)是一种十分常见的老年男性泌尿系统疾病。研究表明，BPH的发生与雌激素调节密切相关，而雌激素在体内的生理作用主要是通过其特异性受体——雌激素受体（estrogen receptor，ESR）的介导来实现的[1-2]，因此，研究雌激素受体有助于揭示BPH的发病机制。本研究通过对ESRα基因进行单核苷酸多态性分析，来观察其在BPH发生、发展中的作用。
1 资料和方法
1.1 一般资料
自2007年5月至2008年5月间收集温州医学院附属第一医院BPH患者112例和健康体检人群作为对照111例的外周血标本。BPH组年龄分布为52～89岁，平均71.0岁，均为经过组织病理证实的BPH患者。健康对照组年龄分布为48～83岁，平均66.6岁，其判定的标准主要为低水平的血清PSA值（&<4.0 μg/μL）、前列腺B超检查正常以及无相应的临床症状。所有研究对象均已事先告知该研究的相关内容，并取得其本人同意。
1.2 方法
1.2.1 总DNA提取：用全血基因组提取试剂盒（TaKaRa公司产品）提取外周血总DNA，置于4 ℃保存，备用。
1.2.2 基因型分析：参照文献[3]合成引物5’-CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3’ (正向)和5’-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTAT CTGA-3’(反向)。PCR反应体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，25 mmol/L的MgC12 4μL，各含2.5 mmol/L的dNTP混合液4.5μL，10 mmol/L的引物各0.5μL，80～200 ng DNA模板，5 U/μL的Ex Taq DNA聚合酶0.2μL，加水至50μL。PCR产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。10μL PCR产物用限制性内切酶消化4 h，酶切产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.3 统计学处理方法
采用Hardy-Weinberg平衡检验来评价采集资料的可靠性。采用非条件Logistic回归分析ESRα基因型和等位基因频率，从而得到经过年龄校准的OR值以及95%CI。采用SHEsis软件分析ESRα基因单体型[4]。
2 结果
2.1 ESRα基因型的酶切结果
PCR产物经过限制性内切酶PvuII消化可形成PP基因型(1 372 bp)，Pp基因型(1 372 bp，936 bp，436 bp)和pp基因型(936 bp，436 bp)；经过限制性内切酶XbaI消化可形成XX基因型(1 372 bp)，Xx基因型(1 372 bp，982 bp，390 bp)，xx基因型(982 bp，390 bp)，见图1。
2.2 ESRα基因Hardy-Weinberg平衡检验
本研究对112例BPH患者和111例健康对照的ESRα基因PvuII和XbaI位点的基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验。结果显示PvuII和XbaI位点基因型的观察值（actual）与预期值（expected）的差异均无显著性（P &>0.05），表明收集的资料具有代表性。
2.3 ESRα基因型和等位基因分布情况
本研究观察了BPH病例组和对照组之间的ESRα基因型和等位基因分布规律，显示其PvuII位点以杂合子基因型Pp占多数，为44.84%（100/223），纯合子基因型PP最少，为14.35%（32/223）；XbaI位点以纯合子基因型xx为主，为64.13%（143/223），纯合子基因型XX最少，仅为4.48%（10/223）。分别比较PvuII和XbaI位点的基因型和等位基因在BPH病例和健康对照中的分布频率，差异均无显著性（P &>0.05），见表1。
2.4 单体型分析
ESRα基因多态性位点PvuII与XbaI间具有较强的连锁不平衡效应（D’=0.958，r2=0.398，来自对照组数据）。ESRα基因单体型包括pX、px、PX和Px四种，本研究人群主要以单体型px分布为主，而单体型pX分布最低。比较BPH病例组和健康对照组人群的单体型分布，本研究发现单体型pX在BPH患者中的分布显著高于健康对照人群（P =0.032108），其OR值为6.394，95%CI为0.919～44.517；单体型px、PX和Px在两者间的差异无显著性（P &>0.05），见表2。
3 讨论
ESR受体属于一类由配体激活的核转录因子，现发现ESR受体存在三种亚型：ESRα、ESRβ和ESRγ，其中ESRα亚型主要分布于前列腺基底上皮细胞和基质间隙[5]，ESRβ分布于前列腺体上皮间隙[6]，而ESRγ目前仅发现存在于硬骨鱼中[7]，在人类前列腺中尚未发现。免疫组化显示，ESRα在正常前列腺腺体上皮细胞中虽未表达，但在前列腺增生细胞中存在高表达[8]，这种表达差异提示ESRα可能与BPH的发生密切相关[9]。因此，研究ESRα基因多态性对于了解BPH的发病机制具有重要的意义。
ESRα基因定位于人类染色体6q25.1上，全序列有140 kb，由8个外显子和7个内含子组成。PvuII（rs2234693）和XbaI（rs9340799）是ESRα基因最常见的两个多态性位点，均分布于第1内含子上，两者仅相距50 bp。PvuII存在碱基T和C的变异，XbaI存在A和G的变异，由于这些变异发生在含有启动子、增强子等重要调节序列的第1内含子上，因而这可能影响到ESRα的表达和功能[10]。Herrrington等[11]认为PvuII位点T转换为C（P等位基因），那么，基因序列上会形成一个能与myb转录因子相结合的位点，即B-myb，这可大大提高下游报告基因的转录水平。因此，P等位基因可提高ESRα转录活性。
我们分析了112例BPH患者和111例健康对照人群ESRα基因PvuII和XbaI位点单核苷酸多态性，结果显示，PvuII和XbaI位点的基因型或等位基因分布频率在BPH患者与健康对照人群之间差异均无显著性，这提示单个SNP可能与BPH发病不相关。然而，在进化学上以等位基因方式表述与疾病易感性相关的多态性，很少由单个多态性导致，大多是基因内几个多态性的组合即单体型所引起。此外，PvuII和XbaI两个位点之间距离较近，这大大增加了位点间相互影响共同作用的可能性。因此，本研究分析两个位点的交互作用，即做连锁不平衡分析。结果显示PvuII和XbaI位点之间存在较强连锁不平衡作用，单体型分析显示携带有pX的个体患前列腺增生的几率为未携带该单体型个体的6.4倍，提示单体型pX是BPH发生的高危险因素。因此，有必要对此类易感人群进行早期干预，预防BPH的发生。
此外，本研究也注意到单体型pX在本地区人群中的分布频率很低，所占比例不到3%，而人群中最常见的单体型为px，比例占到60%以上。与世界其他地区人群的结果相似的这种频率分布特征[12-13]，提示单体型pX引起 BPH的发生虽然风险较大，但影响是局限的。目前老年男性BPH的发病率极高，除了与雄激素水平有关外，雌激素水平也可能是其重要的原因之一，而雌激素主要是通过受体ESRα的作用实现其生理功能，因此，推测除了PvuII和XbaI位点外，ESRα基因还存在其他多态性位点协同影响BPH的发生。
综上所述，ESRα基因PvuII和XbaI多态性与BPH发病可能存在着一定的关联，但这仅仅是初步的，还需更大量的样本数、更多的位点以及更深入的基因功能研究，才能够得到肯定一致的结论。
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