作者：黄晓燕，陈碧新，高瞻，张明英，王赛斌，杨德业
【摘要】 目的?：研究自发性高血压大鼠(SHR)视网膜毛细血管细胞凋亡的发生情况，探讨细胞凋亡与高血压视网膜微血管病变之间的关系，为研究高血压视网膜病变发病机制提供形态学依据。方法：10只雄性自发性高血压大鼠(SHR组)和10只雄性正常血压(WKY)大鼠(WKY组)分别在13周龄和18周龄取眼球做视网膜消化铺片，采用核苷酸末端转移酶介导dUTP缺口翻译法(TUNEL法)检测视网膜微血管细胞凋亡变化情况，HE染色及图像分析，动态观察视网膜微血管形态的改变及测定视网膜毛细血管面积及密度的改变。结果：①TUNEL法标记显示SHR各周龄大鼠视网膜微血管均出现阳性反应细胞，且18周龄大鼠阳性细胞与13周龄大鼠比较明显增多;WKY组大鼠视网膜微血管未见TUNEL阳性细胞。②血管铺片HE染色显示SHR组部分毛细血管闭塞，内皮细胞和周细胞丢失，出现无细胞毛细血管，毛细血管密度较WKY组显著降低。结论：在高血压发展过程中，视网膜毛细血管内皮细胞和周细胞均可发生凋亡，同时伴有微血管稀疏，细胞凋亡可能在高血压视网膜病变的过程中扮演重要的角色。
【关键词】 高血压视网膜病;细胞凋亡;微血管稀少
Abstract: ? Objective: To observe the apoptosis of retinal capillary cells in spontaneously hypertensive rats and study the relationship between apoptosis and hypertensive retinopathy， in order to provide morphological evidence of hypertensive retinopathy. Methods: Experiments were performed on retinas from 13-week-old，18-week-old male SHR?(n?=10)?as experimental group(SHR13 W，SHR18 W)and sex-and age-matched Wistar-Kyoto rats?(WKY)(n?=10)?as control group. Specimens were obtained using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling?(TUNEL)?methods to detect the apoptosis of retinal capillary cells， using hematoxylin and eosin?(HE)?staining to observe the changes of retinal microvascular in morphology and determinate the retinal capillary area density. Results: ①Apoptotic cells labelled by TUNEL were emerged in SHR groups，including 13-week-old and 18-week-old. Apoptotic cells in 18-week-old SHR were significantly more than in 13-week-old SHR. No cell apoptosis was noted in each of WKY group. ②The level of apoptosis gradually increased as the weeks of age increasing in SHR， HE showed that some of capillary was occlusion， endothelial cells and pericytes lost，a large area of cell-free capillary was emerged. Compared with control group，the retinal capillaries area density of SHR was significantly lower than that of the WKY groups. Conclusion: Apoptssis of the endothelial cells and pericytes of the retinal capillary all can occur in the development process of hypertension，at the same time microvascular rarefaction can accompany. Apoptosis may play an important role in the development of hypertensive retinopathy.
Key words: ? hypertensive retinopathy;apoptosis;capillary;microvascular rarefaction
在我国高血压病人群中，高血压性视网膜病变的阳性率为70%左右，其所致眼底血管的改变基本上与高血压3个时期的变化相一致，在一定程度上能反映体内动脉的情况，对判断高血压病的严重程度和预后有一定的价值[1]。有关高血压性视网膜病变的发病机制尚未明了，其微血管结构改变大多是通过检眼镜或眼底荧光素血管造影观察到的，如江时森等[2]通过墨汁灌注法观察到自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)视网膜微动脉存在微血管稀少现象，但在这一病理过程中，视网膜微血管病变是否与细胞凋亡有关鲜见报道。近年来，随着视网膜微血管消化铺片技术的应用，使直接观察视网膜微血管的形态学变化成为了可能。本研究应用视网膜消化铺片，HE染色直接观察视网膜微血管的形态学特征，并对微血管进行定量分析，同时采用TUNEL法特异性标记来观察13周龄和18周龄SHR视网膜毛细血管细胞凋亡情况，旨在探讨细胞凋亡与高血压视网膜微血管病变的关系。
1??材料和方法
1.1??动物模型和试剂??雄性SHR和正常血压大鼠(Wistar-Kyoto，WKY)各10只(其中13，18周龄各5只)，由上海中科院实验动物中心提供。大鼠饲养在温州医学院动物中心的标准化饲养房，饮自来水，标准饲料喂养，生活在昼夜节律为12 h、保持一定温度和湿度的空间。原位细胞凋亡检测试剂盒购于美国Roche公司。显色剂为DAB，购于福州迈新生物技术有限公司。
1.2??血压测定及眼底拍照??用0.35%戊巴比妥麻醉大鼠后，在安静状态下用计算机化多导生理记录仪间接测定鼠尾动脉收缩压，同时在裂隙灯下观察各组大鼠眼底动脉情况，拍照。
1.3??视网膜血管消化铺片的制备??过量麻醉处死大鼠，用新鲜配制的4%多聚甲醛心脏灌流固定后摘除眼球，将眼球置于4%多聚甲醛中4 ℃ 24 h。在显微镜下自角膜缘后0.5 mm处剪开眼球，去除眼前节和玻璃体，剥离视网膜，将其放入3%胰蛋白酶溶液内，37 ℃孵育2～3 h，消化神经组织，然后在蒸馏水中轻轻吹打，仅留一薄层透明的视网膜血管网，将其贴于洁净的载玻片上，自然干燥，待染色。
1.4??视网膜血管形态学改变观察??将制备好的消化铺片进行HE染色，光镜下观察视网膜血管形态学改变，各组大鼠选5张切片，每张切片计数5个高倍视野(×400)，应用Image-Pro Plus 6.0软件分析图像，测定视网膜毛细血管面积密度，毛细血管面积密度(%)=毛细血管总面积/视网膜总面积。
1.5??TUNEL标记法??将视网膜消化铺片按照ROCHE公司提供的TUNEL试剂盒说明书进行原位缺口末端标记检测。样本先用0.01 mol PBS缓冲液浸洗2次各5 min后再按照试剂盒说明书进行。阴性对照：用50μL指示液代替TUNEL反应液;阳性对照：实验前用Dnase-1消化组织(室温30 min)以打断所有细胞DNA链，余步骤同前;各步骤后均用0.01 mmol PBS缓冲液浸洗样本5 min×3次。
普通光镜下观察细胞凋亡，阳性染色随凋亡程度的不同呈浅棕至深棕褐色，定位于胞核，根据下列标准[3]确定着色阳性细胞为凋亡细胞：①单个散在分布;②具有凋亡的核形态(核固缩或染色质浓聚附边或核碎裂);③周围无炎症反应。对于缺乏凋亡核形态的阳性细胞，除非染色强度与背景有鲜明对比，且呈单个分布，否则不认为是凋亡细胞[4]。非凋亡细胞呈紫蓝色，为阴性。
1.5??统计学处理方法??两组间比较采用t检验。
2 结果
2.1??各组大鼠鼠尾动脉收缩压变化??13周龄与18周龄SHR收缩压分别为(148.8±9.9)mmHg、(154.4±17.9)mmHg，WKY分别为(75.9±3.2)mmHg、(75.7±5.9)mmHg，相同周龄SHR组血压与WKY组比较差异均有显著性 (P?&<0.01)，两组组内不同周龄比较，差异均无显著性(P?&>0.05)。
2.2??眼底检查??可见眼底动静脉由视乳头分出后呈放射状，与人眼底不同，无动静脉交叉，无黄斑结构。对照组眼底未见异常(见图1)，SHR组13周龄和18周龄均可见视网膜动脉变细，管径不规则，管壁反光增强，静脉迂曲扩张，视网膜水肿，反光增强，未见到片状出血点(见图2)。根据Reith- Wagener的4级分类法，相当于高血压眼底第I、第II级的改变。
2.3??视网膜血管形态学改变??光镜下，WKY组毛细血管网管径粗细均匀一致，内皮细胞和周细胞均匀分布，内皮细胞核呈椭圆形，位于毛细血管中央或稍偏位，较周细胞略大，与血管平行;周细胞核呈短椭圆形、圆形或三角形，位于毛细血管壁的侧面，稍突出于血管壁(见图3)。SHR组血管管径粗细不均，周细胞和内皮细胞分布不均匀，部分毛细血管结构已破坏，13周龄 SHR部分毛细血管闭塞呈细线状(见图4)，18周龄SHR除了部分毛细血管表现为血管管腔闭塞外，其间无内皮细胞及周细胞影，血管腔完全闭锁，即无细胞毛细血管形成(见图5)。13周龄与18周龄SHR毛细血管面积密度分别为(0.3720±0.0239)、(0.2840±0.0336)，WKY分别为(0.5240±0.0422)、(0.4940±0.0207)，SHR组毛细血管面积密度显著低于WKY组(P?&<0.01)，且随着周龄增加，SHR组毛细血管面积密度逐渐减少(P?&<0.05)。
2.4??视网膜微血管细胞凋亡变化??SHR组大鼠视网膜微血管可见TUNEL阳性细胞，且18周龄阳性细胞与13周龄比较明显增多(见图6、8)，WKY组大鼠视网膜微血管未见TUNEL阳性细胞(见图7、9)。13周龄SHR组每个高倍视野凋亡细胞为(8.8±5.50)个，18周龄SHR组为(19.2±7.08)个，两组比较，差异有显著性(P?&<0.05)。
【摘要】 目的?：研究自发性高血压大鼠(SHR)视网膜毛细血管细胞凋亡的发生情况，探讨细胞凋亡与高血压视网膜微血管病变之间的关系，为研究高血压视网膜病变发病机制提供形态学依据。方法：10只雄性自发性高血压大鼠(SHR组)和10只雄性正常血压(WKY)大鼠(WKY组)分别在13周龄和18周龄取眼球做视网膜消化铺片，采用核苷酸末端转移酶介导dUTP缺口翻译法(TUNEL法)检测视网膜微血管细胞凋亡变化情况，HE染色及图像分析，动态观察视网膜微血管形态的改变及测定视网膜毛细血管面积及密度的改变。结果：①TUNEL法标记显示SHR各周龄大鼠视网膜微血管均出现阳性反应细胞，且18周龄大鼠阳性细胞与13周龄大鼠比较明显增多;WKY组大鼠视网膜微血管未见TUNEL阳性细胞。②血管铺片HE染色显示SHR组部分毛细血管闭塞，内皮细胞和周细胞丢失，出现无细胞毛细血管，毛细血管密度较WKY组显著降低。结论：在高血压发展过程中，视网膜毛细血管内皮细胞和周细胞均可发生凋亡，同时伴有微血管稀疏，细胞凋亡可能在高血压视网膜病变的过程中扮演重要的角色。
【关键词】 高血压视网膜病;细胞凋亡;微血管稀少
Abstract: ? Objective: To observe the apoptosis of retinal capillary cells in spontaneously hypertensive rats and study the relationship between apoptosis and hypertensive retinopathy， in order to provide morphological evidence of hypertensive retinopathy. Methods: Experiments were performed on retinas from 13-week-old，18-week-old male SHR?(n?=10)?as experimental group(SHR13 W，SHR18 W)and sex-and age-matched Wistar-Kyoto rats?(WKY)(n?=10)?as control group. Specimens were obtained using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling?(TUNEL)?methods to detect the apoptosis of retinal capillary cells， using hematoxylin and eosin?(HE)?staining to observe the changes of retinal microvascular in morphology and determinate the retinal capillary area density. Results: ①Apoptotic cells labelled by TUNEL were emerged in SHR groups，including 13-week-old and 18-week-old. Apoptotic cells in 18-week-old SHR were significantly more than in 13-week-old SHR. No cell apoptosis was noted in each of WKY group. ②The level of apoptosis gradually increased as the weeks of age increasing in SHR， HE showed that some of capillary was occlusion， endothelial cells and pericytes lost，a large area of cell-free capillary was emerged. Compared with control group，the retinal capillaries area density of SHR was significantly lower than that of the WKY groups. Conclusion: Apoptssis of the endothelial cells and pericytes of the retinal capillary all can occur in the development process of hypertension，at the same time microvascular rarefaction can accompany. Apoptosis may play an important role in the development of hypertensive retinopathy.
Key words: ? hypertensive retinopathy;apoptosis;capillary;microvascular rarefaction
在我国高血压病人群中，高血压性视网膜病变的阳性率为70%左右，其所致眼底血管的改变基本上与高血压3个时期的变化相一致，在一定程度上能反映体内动脉的情况，对判断高血压病的严重程度和预后有一定的价值[1]。有关高血压性视网膜病变的发病机制尚未明了，其微血管结构改变大多是通过检眼镜或眼底荧光素血管造影观察到的，如江时森等[2]通过墨汁灌注法观察到自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)视网膜微动脉存在微血管稀少现象，但在这一病理过程中，视网膜微血管病变是否与细胞凋亡有关鲜见报道。近年来，随着视网膜微血管消化铺片技术的应用，使直接观察视网膜微血管的形态学变化成为了可能。本研究应用视网膜消化铺片，HE染色直接观察视网膜微血管的形态学特征，并对微血管进行定量分析，同时采用TUNEL法特异性标记来观察13周龄和18周龄SHR视网膜毛细血管细胞凋亡情况，旨在探讨细胞凋亡与高血压视网膜微血管病变的关系。
1??材料和方法
1.1??动物模型和试剂??雄性SHR和正常血压大鼠(Wistar-Kyoto，WKY)各10只(其中13，18周龄各5只)，由上海中科院实验动物中心提供。大鼠饲养在温州医学院动物中心的标准化饲养房，饮自来水，标准饲料喂养，生活在昼夜节律为12 h、保持一定温度和湿度的空间。原位细胞凋亡检测试剂盒购于美国Roche公司。显色剂为DAB，购于福州迈新生物技术有限公司。
1.2??血压测定及眼底拍照??用0.35%戊巴比妥麻醉大鼠后，在安静状态下用计算机化多导生理记录仪间接测定鼠尾动脉收缩压，同时在裂隙灯下观察各组大鼠眼底动脉情况，拍照。
1.3??视网膜血管消化铺片的制备??过量麻醉处死大鼠，用新鲜配制的4%多聚甲醛心脏灌流固定后摘除眼球，将眼球置于4%多聚甲醛中4 ℃ 24 h。在显微镜下自角膜缘后0.5 mm处剪开眼球，去除眼前节和玻璃体，剥离视网膜，将其放入3%胰蛋白酶溶液内，37 ℃孵育2～3 h，消化神经组织，然后在蒸馏水中轻轻吹打，仅留一薄层透明的视网膜血管网，将其贴于洁净的载玻片上，自然干燥，待染色。
1.4??视网膜血管形态学改变观察??将制备好的消化铺片进行HE染色，光镜下观察视网膜血管形态学改变，各组大鼠选5张切片，每张切片计数5个高倍视野(×400)，应用Image-Pro Plus 6.0软件分析图像，测定视网膜毛细血管面积密度，毛细血管面积密度(%)=毛细血管总面积/视网膜总面积。
1.5??TUNEL标记法??将视网膜消化铺片按照ROCHE公司提供的TUNEL试剂盒说明书进行原位缺口末端标记检测。样本先用0.01 mol PBS缓冲液浸洗2次各5 min后再按照试剂盒说明书进行。阴性对照：用50μL指示液代替TUNEL反应液;阳性对照：实验前用Dnase-1消化组织(室温30 min)以打断所有细胞DNA链，余步骤同前;各步骤后均用0.01 mmol PBS缓冲液浸洗样本5 min×3次。
普通光镜下观察细胞凋亡，阳性染色随凋亡程度的不同呈浅棕至深棕褐色，定位于胞核，根据下列标准[3]确定着色阳性细胞为凋亡细胞：①单个散在分布;②具有凋亡的核形态(核固缩或染色质浓聚附边或核碎裂);③周围无炎症反应。对于缺乏凋亡核形态的阳性细胞，除非染色强度与背景有鲜明对比，且呈单个分布，否则不认为是凋亡细胞[4]。非凋亡细胞呈紫蓝色，为阴性。
1.5??统计学处理方法??两组间比较采用t检验。
2 结果
2.1??各组大鼠鼠尾动脉收缩压变化??13周龄与18周龄SHR收缩压分别为(148.8±9.9)mmHg、(154.4±17.9)mmHg，WKY分别为(75.9±3.2)mmHg、(75.7±5.9)mmHg，相同周龄SHR组血压与WKY组比较差异均有显著性 (P?&<0.01)，两组组内不同周龄比较，差异均无显著性(P?&>0.05)。
2.2??眼底检查??可见眼底动静脉由视乳头分出后呈放射状，与人眼底不同，无动静脉交叉，无黄斑结构。对照组眼底未见异常(见图1)，SHR组13周龄和18周龄均可见视网膜动脉变细，管径不规则，管壁反光增强，静脉迂曲扩张，视网膜水肿，反光增强，未见到片状出血点(见图2)。根据Reith- Wagener的4级分类法，相当于高血压眼底第I、第II级的改变。
2.3??视网膜血管形态学改变??光镜下，WKY组毛细血管网管径粗细均匀一致，内皮细胞和周细胞均匀分布，内皮细胞核呈椭圆形，位于毛细血管中央或稍偏位，较周细胞略大，与血管平行;周细胞核呈短椭圆形、圆形或三角形，位于毛细血管壁的侧面，稍突出于血管壁(见图3)。SHR组血管管径粗细不均，周细胞和内皮细胞分布不均匀，部分毛细血管结构已破坏，13周龄 SHR部分毛细血管闭塞呈细线状(见图4)，18周龄SHR除了部分毛细血管表现为血管管腔闭塞外，其间无内皮细胞及周细胞影，血管腔完全闭锁，即无细胞毛细血管形成(见图5)。13周龄与18周龄SHR毛细血管面积密度分别为(0.3720±0.0239)、(0.2840±0.0336)，WKY分别为(0.5240±0.0422)、(0.4940±0.0207)，SHR组毛细血管面积密度显著低于WKY组(P?&<0.01)，且随着周龄增加，SHR组毛细血管面积密度逐渐减少(P?&<0.05)。
2.4??视网膜微血管细胞凋亡变化??SHR组大鼠视网膜微血管可见TUNEL阳性细胞，且18周龄阳性细胞与13周龄比较明显增多(见图6、8)，WKY组大鼠视网膜微血管未见TUNEL阳性细胞(见图7、9)。13周龄SHR组每个高倍视野凋亡细胞为(8.8±5.50)个，18周龄SHR组为(19.2±7.08)个，两组比较，差异有显著性(P?&<0.05)。
3??讨论
高血压视网膜病变是高血压最重要的靶器官损害之一。眼底视网膜血管属微血管范畴，是全身可以直接在体外观察的微血管，观察视网膜微血管的改变将有助于高血压视网膜病变及其他高血压靶器官损害的研究。微血管稀少是指高血压时直径&<40μm微动脉及毛细血管在数量上的减少[5]。Hutchins等[6]于1974年首次指出微血管稀少是高血压的重要特征。Pewitt等[7]指出微血管稀少分两个阶段：在早期毛细血管密度降低是功能性的，是由于血管收缩所致的无灌注现象;后期则为器质性微血管稀少，即毛细血管的真正关闭，表现为毛细血管数目在解剖上的稀少，一旦过渡为此阶段即被认为是走出了高血压导致靶器官结构性损害的第一步，而且是不可逆的。早期视网膜毛细血管密度的下降可直接影响交换面积，进而影响组织、细胞的物质交换，局部物质代谢能力有所下降，出现局部组织细胞的损害，氧分压降低、缺血和低氧而导致视细胞外节和节细胞等结构发生病理改变，从而形成在高血压早期即造成高血压靶器官损害——高血压视网膜病变[8-9]。
本实验通过应用视网膜消化铺片直接观察视网膜微血管来反映高血压状态下的微血管改变，结果显示，13周龄及18周龄SHR视网膜毛细血管密度较同期WKY组有明显下降，出现了微血管稀少，且同时出现血管壁结构的改变，表明SHR大鼠视网膜微血管出现了器质性稀少或功能性与器质性稀少并存的状况。
近年的研究发现，细胞凋亡在微血管稀少方面起一定的作用。血管细胞凋亡是高血压发生与发展的重要细胞学基础。1995年国外学者Hamet[10]提出，可能是细胞凋亡导致了微血管稀少。Gobe等[11]在建立的一肾一夹Goldblat高血压大鼠模型的研究中发现，实验动物心肌小动脉及骨骼肌内微血管数量的明显减少与血管内皮细胞发生凋亡有关，认为高血压时细胞凋亡在微血管稀少中扮演了一个重要角色。本研究通过TUNEL染色铺片观察到，13周龄和18周龄SHR大鼠均发现有TUNEL染色阳性细胞，且18周龄SHR组TUNEL阳性细胞与13周龄组比较明显增多。Kobayashi等[12-13]提出氧化应激促进血管内皮细胞凋亡和微血管稀疏，并认为通过应用可透过细胞的过氧化物清除剂进行抗氧化处理可抑制内皮细胞凋亡及防止自发性高血压大鼠的微血管稀疏。可以诱导微血管细胞凋亡的因素很多，但引起凋亡的机制尚不清楚，尚待进一步研究。
上述结果表明，细胞凋亡可能是促进高血压靶器官损害---高血压视网膜病变病程发展、病情恶化的重要原因之一，在微血管稀少中扮演着重要的角色，是促进高血压的发生和发展的重要细胞学基础。设法干预凋亡从而减少组织细胞损害是一项重要课题。阻止早期微血管细胞的凋亡，改善微血管稀少，可能为治疗高血压视网膜病变及防治高血压靶器官损害开辟一条新的途径。
参考文献
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[2] 江时森，顾小平，李辉.自发性高血压大鼠多器官微血管稀少动态观察[J]. 微循环技术杂志，1996，4(2):73-75.
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[10] Hamet P. Proliferation and apoptosis in hypertension [J].Curr Opin Nephrol Hypertens， 1995， 4(1):1-7.
[11] Gobe G， Browning J， Howard T， et al. Apoptosis occurs inendothelial cells during hypertension-induced microvascu-lar rarefaction [J]. Struct Biol， 1997， 18(1): 63-72.
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