作者：潘俊， 陈凌武， 王文卫， 瞿虎， 王声正
【摘要】 【目的】 研究抑癌基因细胞凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)和腺瘤性结肠息肉病相关基因(APC)的启动子甲基化状况与膀胱癌临床病理的关系及对患者复发的影响。【方法】采用甲基化特异性PCR方法检测110例膀胱癌组织中Apaf-1和APC的启动子甲基化状态，以15例正常膀胱黏膜组织为对照组。【结果】 Apaf-1和APC基因在膀胱癌组织中的甲基化率为90.0%和82.7%，在正常膀胱组织为6.77%和20.0%，差异分别有统计学意义(P均 = 0.000)。Apaf-1及APC的甲基化率与肿瘤分化程度及临床分期有明显的相关性，随肿瘤分级、分期的增加而升高。在复发组与未复发组的比较中，Apaf-1的甲基化阳性率分别为97.6%(41/42)和85.3%(58/68)，差异有统计学意义(χ2 = 4.382，P = 0.036)，而APC的甲基化率分别为85.7%(36/42)和80.9%(55/68)，差异无统计学意义(χ2 = 0.424， P = 0.515)。【结论】 Apaf-1及APC的甲基化改变在膀胱癌的发生、发展过程中具有重要作用，Apaf-1启动子甲基化可能成为膀胱癌患者预后判断的分子标志物。
【关键词】 膀胱癌; 甲基化; 肿瘤抑制基因; Apaf-1; APC
Abstract： 【Objective】 To study the Apaf-1 and APC promoter methylation status and its relation with clinical pathology and prognosis of bladder carcinoma. 【Methods】 Methylation status of Apaf-1 and APC gene promoter in 110 specimens of bladder carcinoma and 15 normal bladder tissues were detected by methylation-specific PCR. 【Results】 The methylation rate of Apaf-1 and APC were significantly higher in bladder carcinoma (90.0%， 82.7%) than that of normal bladder tissues (6.77%， 20.0%) respectively with statistically significant differences (P = 0.000). The methylation rate of Apaf-1 and APC correlated well with the different grades and stages of bladder carcinoma respectively， increased with the development of tumor grades and stages. Between the recurrent group and the non-recurrent group， the methylation rates of Apaf-1 were 97.6% (41/42) and 85.3% (58/68)， with statistically significant differences (χ2 = 4.382， P = 0.036); APC were 85.7%(36/42) and 80.9%(55/68)， with no statistically significant differences (χ2 = 0.424， P = 0.515). 【Conclusion】 The methylation status of Apaf-1 and APC was related closely to the development of bladder carcinoma， the methylation status of Apaf-1 may become a new potential biomarker of prognosis in bladder carcinoma.
目前普遍认为，在肿瘤转化过程中抑癌基因功能的失活比原癌基因的激活起更关键作用，而DNA异常甲基化可直接修饰和关闭抑癌基因的功能。细胞凋亡蛋白酶活化因子-1基因(apoptotic protease activating factor-1， Apaf-1)是c-Myc诱导肿瘤细胞凋亡中p53的下游成分， Apaf-1基因可以控制肿瘤的发展。已证实在白血病等恶性肿瘤中都出现了Apaf-1基因转录和翻译水平的下调[1]，但在泌尿系肿瘤尤其是膀胱癌中有关Apaf-1的研究报道相对较少[2]。Wnt信号传导通路的异常激活在泌尿系肿瘤的发生中起着重要作用，虽然腺瘤性结肠息肉病相关基因(adenomatous polyposis coli， APC)是Wnt信号的下游抑制因子， 但APC基因在膀胱癌的发生、发展中是否起着重要作用存在着争论[3-4]。因此，本研究采用甲基化特异性PCR法(MSP法)检测Apaf-1和APC基因在膀胱癌中的启动子甲基化状况，并分析其与膀胱癌临床特点的关系及在患者术后复发监测中的应用价值。
1 材料和方法
1.1 临床资料
收集2001年1月至2005年12月在我院确诊为膀胱移行细胞癌的患者的临床资料，入选条件：①临床资料完整。②蜡块内组织较大，可供提取DNA。筛选出150名患者，成功随防到110患者，随防成功率73.3%，其中男78例，女32例。手术时年龄36 ～ 72岁，平均62.5岁。病理分级按WHO 2004分级标准，低级别60例，高级别50例;临床分期按国际抗癌协会UICC-TNM分期标准，浅表性(Tis ～ T1)48例，侵润性肿瘤(T2 ～ T4)62例。另取15例正常膀胱粘膜组织常规石蜡包埋切片作对照组。15例正常膀胱粘膜组织标本均来自于行膀胱全切术时在离肿瘤边缘5 cm以外的无肿瘤组织，HE染色病理学检查确认无肿瘤细胞。
1.2 石蜡切片中DNA组织的提取
每个标本切取10 μm厚度切片3 ～ 4张，无需脱蜡，直接用TaKaRa DEXPATTM试剂盒(大连宝生)，按步骤向石蜡包埋组织切片上加入TaKaRa DEXPATTM后，只需100 ℃加热和4 ℃离心，就可以得到PCR扩增用DNA，紫外分光度仪确定DNA的含量和纯度。
1.3 甲基化特异性PCR分析
采用CPGenomeTM DNA Modification Kit试剂盒(Chemicon，USA)，对样本DNA进行亚硫酸氢钠修饰并纯化回收，引物设计采用Primer premier 5.0 引物设计专门软件，由Invitrogen公司鉴定合成。Apaf-1的甲基化引物5′ AGGAAATTTAAA TTTTCGGGC 3′(F)， 5′ CGCGAACGAAACGTAAC TA 3′ (R)，非甲基化引物5′ GAGGAAATTTAAAT TTTTGGGT 3′(F)，5′ CCACAAACAAAACATAAC TA 3′(R)。APC的甲基化的引物5′ TGTTTTATT GCGGAGTGC 3′(F)，5′ AACCACATATCGATCAC GTAC 3′(R)，非甲基化引物5′ TTGTGTTTTATTG TGGAGTGT 3′(F)，5′ AACCACATATCAATCACA TACACC 3′(R)。反应体系包括去离子水18.15 μL，10 × PCR缓冲液2.5 μL，dNTPs 1 μL，Taq酶0.35 μL，U或M-引物F 1 μL， U或M-引物R 1 μL及修饰后的DNA 1 μL。Apaf-1的PCR循环条件为95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，退火温度(甲基化引物55 ℃，非甲基化引物52 ℃) 30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环后72 ℃延伸5 min。扩增片段长度甲基化引物170 bp，非甲基化161 bp。APC的PCR循环条件为95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，退火温度(甲基化引物52 ℃，非甲基化引物50 ℃) 30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环后72 ℃延伸5 min，扩增片段长度甲基化引物150 bp，非甲基化141 bp。以双蒸水作为空白对照。取PCR产物5 μL，应用2%琼脂糖凝胶电泳，100 V电泳40 min，电泳结果经激光密度扫描仪成像进行分析。甲基化引物扩增阳性者为甲基化阳性，非甲基化引物扩增阳性且甲基化引物扩增阴性者为甲基化阴性。
1.4 统计学分析
采用SPSS 10.0统计软件，甲基化阳性率的比较采用χ2检验，检验水平α = 0.05。
2 结 果
2.1 膀胱癌组织Apaf-1、APC基因启动子甲基化状态与临床病理的关系
Apaf-1、APC启动子甲基化特异性PCR产物电泳结果见图1、2。正常膀胱组织和膀胱癌组织中的Apaf-1启动子甲基化率分别为6.77% (1/15)和90.0%(99/110)，差异有统计学意义(χ2 = 57.29， P = 0.000);APC启动子甲基化率分别为20.0%(3/15)和82.7%(91/110)，差异有统计学意义(χ2 = 27.85，P = 0.000)。Apaf-1、APC启动子甲基化阳性率随肿瘤分级、分期的增加而显著升高， 差异分别有统计学意义(P &< 0.05);而不同性别、不同年龄以及肿瘤单发与多发之间的比较分别无显著性差异(P ﹥ 0.05;表1)。有淋巴结转移的患者Apaf-1启动子甲基化阳性率明显高于无淋巴结转移的患者(P &< 0.05)。
2.2 Apaf-1、APC的甲基化表达状况与患者复发的关系
Apaf-1的甲基化阳性率在复发组与未复发组中分别为97.6%(41/42)和85.3%(58/68)，差异有统计学意义(χ2 = 4.382， P = 0.036)。APC的甲基化阳性率在复发组与未复发组中分别为85.7%(36/42)和80.9%(55/68)，差异无统计学意义(χ2 = 0.424， P = 0.515)。
3 讨 论
肿瘤的形成受遗传学和表观遗传学修饰的影响，而甲基化是目前研究最为深入的表观遗传学机制。肿瘤细胞DNA甲基化模式表现为局部特异位点如CpG岛高甲基化和整体广泛低甲基化状态[5]。近年来的研究证实在膀胱癌的发生、发展过程中相关基因CpG岛的甲基化紊乱发生率很高[6-7]。Apaf-1基因作为一个抑癌基因较少发生突变，引起该基因功能缺失的机制有杂合性丢失(loss of heterozygosity， LOH)和启动子甲基化， 其中甲基化引起的基因功能“静默”是该基因表达下调的主要原因[8]。我们研究发现，在正常膀胱粘膜组织中Apaf-1的甲基化率非常低，为6.77%(1/15)，仅有1例可检测到少量的甲基化，而膀胱癌组织中其甲基化率则高达90.0%(99/110)，仅有11例甲基化表现不明显，因此，我们认为Apaf-1的甲基化检测可用于临床上鉴别膀胱良恶性肿瘤。另外，Apaf-1甲基化率在高级别、侵润型的膀胱癌中均高达100%，明显高于低级别、表浅型的膀胱癌，提示Apaf-1基因启动子高甲基化的膀胱癌具有较高的恶性生物学行为，与预后不良密切相关。而不同性别、不同年龄以及肿瘤单发与多发之间的比较并无统计学差异，但其甲基化状况与是否出现淋巴结转移有着明显的联系，考虑Apaf-1甲基化阳性的肿瘤转移及侵袭能力较强。随访表明，在复发组与未复发组中Apaf-1启动子甲基化率(97.6%： 85.3%)有统计学差异，提示Apaf-1甲基化阳性的患者术后可能有较高的复发率。研究证实，基因CpG岛的甲基化改变往往发生在明显的恶性表现出现之前[9]，故对Apaf-1基因DNA甲基化检测可以评估膀胱癌远期复发的风险并对复发作出提前预测。
Wnt信号传导通路的异常激活与人类肿瘤的发生发展密切相关，APC是Wnt信号的下游抑制因子，APC失活后则会导致β-catenin降解减少，胞质β-catenin转移到细胞核与Tcf-4结合，活化靶基因刺激肿瘤生长[10-11]。研究证明在结肠癌等消化道肿瘤中APC启动子的甲基化率很高[12]，而在膀胱癌中它的甲基化如何国内外相关报道较少，观点也不尽相同。Stoehr R等[3]研究认为，尽管Wnt的信号传导途径在包括泌尿系肿瘤的许多肿瘤发生中起着重要作用，但APC基因的突变和表达缺失却是少见事件。而Kastritis E等[4]却认为APC的突变及异常表达在侵润性的尿路上皮癌中却并不少见，而且可能有判断预后的重要价值。本研究发现正常膀胱组织和膀胱癌的APC启动子总甲基化率分别为20.0%和82.7%，差异有统计学意义，提示APC基因与膀胱癌的发生密切相关，用于膀胱癌的早期诊断和鉴别良恶性膀胱肿瘤方面具有重要价值。同时，发现APC的甲基化率在不同级别、不同分期的癌组织中有明显差别，其表达随肿瘤的分级、分期的增加而明显升高，表明APC的甲基化是膀胱癌形成的早期事件并在癌细胞的恶性转化过程中逐步积累，与膀胱癌的发生存在密切关系。但是在复发组与未复发组中APC的甲基化率无明显的统计学差异，表明其预测膀胱癌复发作用的局限性。
综上所述，Apaf-1、 APC基因的高甲基化状态在膀胱癌的发生、发展过程中起着重要作用，如能进一步与其它抑癌基因组成膀胱癌的甲基化检测谱，将对患者的早期诊断与预后的监测提供一种新的、非创伤性的手段。
参考文献
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