作者：周伟民，金培英，平金良，钱福初，张国雷
【摘要】 目的?：探讨硼替佐米对核因子-κB(NF-κB)活化的干预作用及对人LOVO细胞增殖的影响。方法：体外培养人LOVO结肠癌细胞并给予不同浓度的硼替佐米，以Western blot和ELISA法分别检测IκBα和NF-κB的表达;以MTT法和Annexin V-FITC/PI双色标记法分别检测细胞增殖和细胞凋亡的变化。结果：硼替佐米作用LOVO细胞后，胞浆IκBα和NF-κB的水平逐渐上升，而胞核NF-κB的水平明显降低(P?&<0.01)，并呈一定的浓度依赖性，高浓度时作用最明显(P?&<0.01);硼替佐米能明显抑制LOVO细胞的增殖，并呈一定的剂量和时间依赖性。随着硼替佐米浓度的上升，细胞凋亡率明显增加(P?&<0.01)。结论：硼替佐米通过抑制IκBα的降解能有效地干预NF-κB活化，抑制LOVO细胞的增殖并诱导细胞发生凋亡。
【关键词】 硼替佐米;结肠肿瘤;核因子-κB;LOVO;凋亡
Abstract: ? Objective: To investigate the influences of LOVO cells of the intervention of nuclear factor-κB (NF-κB) activation by bortezomib on the proliferation. Methods: LOVO cells was cultured in vitro and treated with different concentrations of bortezomib. The expressions of IκBα and NF-κB were analyzed by western blot and enzyme linked immunosorbent assay， respectively. The changes of cell growth and apoptosis were investigated by MTT assay and Annexin-V/PI double dyeing assay，respectively. Results: In bortezomib-treated cells，the expressions of IκBα and NF-κB in cytopalsm were obviously upregulated， while the level of NF-κB in nucleus was sharply downregulated in a dose-dependent manner (P?&<0.01)， which was the most effective at the concentration of 80 nmol/L (P?&<0.01). Bortezomib significantly inhibited the proliferation of LOVO cell in a dose-?and time-dependent manner. The percentage of apoptotic cells in bortezomib group was higher than that in control one (P?&<0.01). Conclusion: Bortezomib can effectively intervene NF-κB activation in LOVO cells by suppressing the degradation of IκBα， inhibit the proliferation of LOVO cells and induce cell apoptosis.
Key words: ? bortezomib;colon carcinoma;nuclear factor-κB;LOVO;apoptosis
核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是具有多向性调节作用的转录因子，参与细胞增殖与凋亡的调节，并且能直接影响细胞周期或DNA复制，从而参与体内多种生理和病理的过程。激活的NF-κB在炎症相关性结肠癌的发生发展中呈高表达，在慢性肠道炎症和癌变之间起桥梁作用[1]。硼替佐米(万柯，PS-341)是一种蛋白酶体抑制剂，主要用于治疗多发性骨髓瘤，其中的机制之一在于它能明显抑制NF-κB信号通路的活化[2]。因此本研究以不同浓度的硼替佐米作用LOVO结肠癌细胞株，探讨硼替佐米对NF-κB活化的干预作用及对LOVO细胞增殖的影响。
1??材料和方法
1.1??实验对象与主要试剂??人LOVO结肠癌细胞株，由南京凯基生物科技发展有限公司提供。硼替佐米(Millennium，美国)购自西安杨森制药公司;DMEM及胎牛血清(Gibco BRL，美国)购于Hyclone公司;MTT、Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒、细胞核蛋白与浆蛋白抽提试剂盒及BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物技术研究所;人NF-κB ELISA试剂盒(Cusabio，美国)购自武汉华美生物技术有限公司。兔抗人NF-κB(P65)一抗、兔抗人IκBα一抗、鼠抗人β-action一抗、HRP-羊抗兔二抗、HRP-羊抗鼠二抗、PVDF膜及SDS-PAGE凝胶配制试剂盒均购自碧云天生物技术研究所。
1.2??实验方法
1.2.1??细胞培养及分组：LOVO细胞常规复苏后，以完全培养液(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养液，简称完培)在37 ℃、5%二氧化碳及100%湿度的条件下培养。适时传代，取对数生长期细胞进行实验。将细胞分为实验组和对照组，每组设三个复孔。以完培溶解硼替佐米，稀释成10 nmol/L、20 nmol/L、40 nmol/L、80 nmol/L和160 nmol/L五个浓度梯度。
1.2.2??MTT法：以每孔104个细胞接种96孔培养板。常规培养24 h后弃去培养液，加入含有硼替佐米的完培100μL。在此后的24 h、48 h及72 h，每孔加入20μL MTT(5?mg/mL)，37 ℃继续培养4 h，小心弃去上清，每孔再加入200μL DMSO，避光震荡10 min。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光值。抑制率= [1-(实验孔OD值/空白对照OD值)]×100%。
1.2.3??细胞凋亡检测：以每孔5×104细胞接种24孔培养板，24 h后弃去培养液，加入含有硼替佐米的完培0.5 mL，48 h后吸出各孔培养液至离心管，PBS洗涤细胞2次，常规消化收集细胞于对应的离心管内，离心1?000 r/min×5 min，弃上清，PBS洗涤细胞2次。加入195μL Annexin V-FITC结合液(1×)重悬细胞，再加入5μL Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min。离心1?000 r/min×5?min，弃上清，加入190μL Annexin V-FITC结合液(1×)重悬细胞。加入10 μL PI染色液，冰浴避光放置。使用流式细胞仪进行检测分析。
1.2.4??蛋白抽提：以每孔2×105细胞接种六孔培养板，24 h后换用添加硼替佐米的完培培养48 h，以细胞刮子收集细胞，1?000 r/min×5 min。弃上清，留下细胞沉淀。按照细胞核蛋白与浆蛋白抽提试剂盒说明书提取细胞核蛋白与浆蛋白，-80 ℃保存备用。以BCA法测定蛋白浓度。具体操作严格按照试剂盒说明书进行。
1.2.5??胞核NF-κB的定量检测：以ELISA法定量分析胞核内NF-κB的水平。操作简单如下：以样品稀释液对标准品进行倍比稀释，吸取100μL标准品或待测样品加入酶标板的反应孔底部。盖板混匀，37 ℃×120 min，弃去孔内液体，拍干。每孔加100μL生物素标记的抗体，37 ℃×60 min，弃去孔内液体，反复洗板3次，拍干。每孔加100μL HRP标记的亲和素，37 ℃×60 min。弃去孔内液体，反复洗板5次，拍干。每孔依次加入90μL底物溶液，37 ℃避光放置约30 min。立即依次加入50μL终止液，混匀后测定A450。绘制标准曲线，计算样品的浓度，结果以NF-κB/核蛋白(ng/mg核蛋白)表示。
1.2.6??胞浆IκB和NF-KB表达的Western Blot分析：参照SDS-PAGE凝胶试剂盒制作10%分离胶和4%浓缩胶，取40μg蛋白与SDS上样缓冲液混匀后沸水中煮5 min，然后电泳分离蛋白，先恒压80 V×35 min，后100 V×60 min。准备1张PVDF膜，用100%甲醇极化3～5 s，ddh3O漂洗约10 min，打开转膜夹子，依次铺上1层海绵垫和2层滤纸，剥下分离胶盖于滤纸上，盖上PVDF膜，再依次铺上2层滤纸和1层海绵垫，最后合紧夹子放入转移槽内，恒流300 mA×110 min。以洗涤缓冲液(TBS-T)在脱色摇床上洗膜，以封闭液(脱脂奶粉2.5 g+TBS-T50 mL)摇动封闭1 h。以TBS-T洗膜后加入一抗，即兔抗人NF-κB(P65)(1:500)、兔抗人IκB(1:500)或鼠抗人actin(1:500)，4 ℃过夜，以TBS-T洗膜后加入二抗一HRP标记的山羊抗兔IgG(1:500)或山羊抗鼠IgG(1:500)，室温下孵育2 h，以TBS-T洗膜后加ECL发光液显色，在凝胶成像分析仪上摄像或胶片显影。
1.3??统计学处理方法??用Stata7.0统计软件处理数据，多个样本均数间的比较先进行方差齐性检验，方差相等时采用t检验或者方差分析。
2??结果
2.1??硼替佐米对LOVO细胞增殖的影响??硼替佐米作用LOVO后，细胞增殖明显受到抑制，并且呈现明显的剂量和时间依赖性(见图1)。在80 nmol/L范围内，随着药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞抑制率均呈明显的线性上升。而当硼替佐米的浓度达到并超过80 nmol/L时，细胞的抑制率基本维持在60%的水平，此时再增加药物浓度和延长药物作用时间，抑制率增加均不明显。24 h、48 h及72 h的IC50分别为68.22 nmol/L、35.85 nmol/L及31.75 nmol/L。
2.2??硼替佐米诱导LOVO细胞凋亡??硼替佐米作用LOVO细胞48 h后，细胞凋亡率明显增加(P?&<0.05)，呈现一定的剂量依赖性(见图2)。随着药物浓度增加，凋亡细胞比列明显上升(F=41.79，P&<0.01)。80 nmol/L组和40 nmol/L组的细胞凋亡率均明显高于对照组(q=15.32，P&<0.01;q=8.21，P&<0.01)，分别是对照组的5.8倍和3.5倍。
2.3??硼替佐米对IκBα和NF-κB表达的影响 ??Western blot结果显示：硼替佐米作用LOVO细胞48 h后，IκBα的表达在硼替佐米组明显高于对照组，并随着药物浓度的增加呈上升趋势(见图3)。硼替佐米作用后，细胞浆蛋白中可检出的NF-κB(P65)也明显上升，而核蛋白中可检出的NF-κB(P65)逐渐降低，并呈一定的剂量依赖性，以80 nmol/L时最明显(见图4)。以NF-κB/核蛋白(ng/mg核蛋白)对核蛋白中NF-κB进行定量分析详见表1：随着硼替佐米浓度的增加，核蛋白中的NF-κB水平逐渐降低，以80 nmol/L时为最低(F=51.53，P&<0.01)，这与Western blot的结果一致;对照组NF-κB的浓度明显高于硼替佐米组(P?&<0.01)，大约是80 nmol/L组的12倍，40 nmol/L组的7倍，20 nmol/L组的3.5倍。
3??讨论
结肠癌的发生发展是一个多基因调控和多阶段的过程，涉及多种细胞因子的异常表达及其信号途径的过程，其中持续的NF-κB活化与结肠癌的发生发展密切相关[3]。NF-κB是一种与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列特异性结合的蛋白质因子，通常情况下NF-κB是与其抑制蛋白(IκB)结合而以无活性的形式存在于胞浆中。当受到细胞因子等刺激后，IκBα通过磷酸化、泛素化而被蛋白酶体降解，游离的NF-κB进入细胞核内，与靶基因的κB位点结合，发挥其转录调节作用，参与调控体内多种生理和病理的过程，与恶性肿瘤的发生、发展和转移密切相关，近年来干预NF-κB活化有望成为恶性肿瘤治疗的新靶点[4-5]。本研究以硼替佐米干预NF-κB信号通路，观察其对LOVO细胞增殖的影响，从而为结肠癌的靶向治疗提供实验依据。
硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，可抑制真核细胞26S蛋白酶体对多种蛋白质的降解，促使与细胞增殖、分化和凋亡密切相关的多种蛋白发生代谢紊乱，诱导细胞凋亡。硼替佐米作为一种新型抗肿瘤靶向药物，已经广泛用于多发性骨髓瘤的治疗，对白血病、乳腺癌、肺癌、胰腺癌及前列腺癌等恶性肿瘤也具有明显的抗肿瘤作用，近年来硼替佐米也被用于结直肠癌治疗的研究，抑制IκB降解干预NF-κB的核转位可能是其抗肿瘤作用的重要机制[6-9]。本研究中硼替佐米能明显上调LOVO细胞中IκBα的表达，使胞浆NF-κB表达上升，而胞核NF-κB的表达明显降低，并呈一定的剂量依赖性。提示硼替佐米通过抑制IκBα的降解而抑制NF-κB从胞浆进入胞核，进而干预NF-κB信号通路的活化。
NF-κB能直接作用于细胞周期或DNA复制，通过促进其下游靶基因cyclin D的表达加速细胞周期从G1期向S期转化，使细胞增殖失控从而参与肿瘤的发生发展[10]。给予硼替佐米抑制NF-κB活化后，LOVO细胞的增殖明显受到了抑制，并且呈一定的剂量和时间依赖性，在80 nmol/L范围内，随着药物浓度的增加和给药时间的延长，细胞抑制率均呈明显的线性上升。而当药物浓度达到并超过80 nmol/L时，细胞的抑制率维持在60%的水平且趋于稳定，基本不受药物浓度和作用时间的影响。提示80 nmol/L的硼替佐米对LOVO细胞内26S蛋白酶体的抑制作用已经达到了饱和状态。
NF-κB是多种抗凋亡基因表达的主要激活子，NF-κB信号通路的活化是恶性肿瘤细胞抵抗凋亡、耐药的重要原因。活化的NF-κB可促进TRAF1、TRAF2、凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，c-IAP1)及c-IAP2等的表达，这些基因产物相互协同可在早期抑制TNF-α及抗癌药物诱导的细胞凋亡[11];同时NF-κB对caspase-8的直接阻断作用而由此抑制一系列caspase的活化也是其抗细胞凋亡的重要机制[12]。硼替佐米作用LOVO细胞后，细胞凋亡率明显增加。80 nmol/L的硼替佐米作用48 h后，LOVO细胞的凋亡率达到了22.73%±3.74%，明显高于对照组(3.95% ±0.81%)。提示硼替佐米可诱导结肠癌细胞凋亡，其中重要的机制在于硼替佐米有效干预了细胞内NF-κB信号通路的活化。
结肠癌的治疗除了手术外，化疗和放疗是常用的手段，而肿瘤对放化疗抵抗是目前治疗的难题。研究显示NF-κB信号通路的活化与肿瘤对化疗药物耐药和放射线抵抗密切相关，硼替佐米与化疗药物、放射线联合具有明显的放化疗增敏作用[13-15]，提示可进一步探讨硼替佐米对结直肠癌的放化疗增敏效应。
硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，可有效干预NF-κB信号通路的活化，从而抑制恶性细胞增殖，抵抗细胞凋亡，逆转细胞耐药，并能抑制肿瘤血管的生成，因而在恶性肿瘤的靶向治疗中具有良好的应用前景[16]。本研究表明，硼替佐米能通过抑制IκBα的降解明显抑制LOVO细胞内NF-κB的活化，进而抑制LOVO细胞的增殖，诱导细胞凋亡，提示硼替佐米可用于结肠癌的靶向治疗。
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