作者：张迎光，施晓聪，林全思，王震，吕建新
【摘要】 目的 ：从环境中分离高产脂肪酶的细菌，并克隆其脂肪酶基因。方法：从天然高油脂含量土壤筛选高产脂肪酶的细菌，鉴定菌种后，设计相应引物PCR扩增脂肪酶基因并进行TA克隆，重组载体转入E.coli DH5α构建工程菌，双酶切及测序鉴定脂肪酶基因。结果：经过微生物菌种鉴定获得4株高活力菌，其中一株金葡菌产酶最高，利用PCR技术成功扩增脂肪酶基因，该基因经过克隆测序及其双酶切鉴定证实为新发现的突变脂肪酶基因，其二级结构与标准基因(EU310372)有较大不同。结论：成功分离一株高产脂肪酶的菌株——金黄色葡萄球菌，克隆的脂肪酶基因为新发现的突变型。
【关键词】 脂肪酶基因；PCR；TA克隆
Abstract: Objective: To separate natural bacteria producing high activities lipase from environment，and clone its lipase gene. Methods: High activities lipase producing bacteria was screened from soil which contained plenty of oils and fats. After identifying bacteria，PCR amplified lipase gene which was cloned to pMD18-T Vector. The recombint plasmid was transformed into E. Coli DH5αto build the engineering bacteria. At last，the lipase gene was identified with two restriction endonuclease digesting and sequencing. Results: After identifiying，4 producing high activitie lipases bacteria strains were obtained，one of which was a Staphylococcus aureus producing highest activities lipase，its lipase gene was amplified by PCR，then separated and identified as a new mutant lipase gene by restriction endonuclease digesting and sequencing. standard lipase gene registered on NCBI (EU310372)，The secondary structure of the new mutant lipase gene was more different from standard lipase. Conclusion: A strain of high activities lipase producing bacteria-Staphylococcus aureus is successfully isolated and the cloned lipase gene is a new discovered mutant type.
Key words: lipase gene；PCR；TA cloning
脂肪酶是一类酯键水解酶，广泛存在于微生物、植物种子及动物组织中，能在油水界面上催化脂类物质分解、合成和酯交换反应。作为重要的工业用酶，脂肪酶在医药、食品、制革、饲料、洗涤、油酯化工等传统工业领域有着广泛的应用，如可添加在洗涤剂增加去油脂能力，添加在高脂食物以增加口感，而近年来其在生物能源、有机合成、药物手性拆分和工具酶等新领域也展现了良好的应用前景[1]。以上领域应用的脂肪酶，或为天然菌分离或为基因重组来源，但其微生物来源脂肪酶应用最广泛[2-5]。据统计，细菌有28个属，放线菌有4个属，酵母菌有10个属，其他真菌有23个属，共计达65个属的微生物产脂肪酶。而动物脂肪酶、植物脂肪酶由于其作用底物谱窄，体外表达活性、产量低，该类基因很少作为基因工程的脂肪酶来源基因[6-8]。
本课题拟通过从高含油脂的环境中分离到产高活力脂肪酶的微生物并克隆高活力脂肪酶基因，为后续的获得工程菌清除高油脂污水、获得较高活力脂肪酶基因并通过基因工程获得高活力、高产量的重组脂肪酶研究打下一定基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
E.coli DH5α由温州医学院浙江省医学遗传学重点实验室提供；限制性内切酶Ndel，Hind III，NcoI，XhoI，pMD-18 T vector，T4连接酶、Tag DNA聚合酶、胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0）、基因组提取试剂盒，均购自宝生物工程有限公司；橄榄油、聚乙烯醇（PVA）、溴甲酚紫购自上海三爱思试剂有限公司。
1.2 产脂肪酶天然菌株的筛选及鉴定
产脂肪酶细菌主要从自然界中筛选，采集温州汽车站，茶山镇及温州医学院茶山校区周围的油污丰富的土壤，供分离使用。共采集到土壤样品14份(包括:河道污泥、餐厅厨房清洗处污泥、菜市场肉案上木屑、修车店门前污泥、饮食店油烟机油渍等)。筛选方法是：样品经富集培养、平板初筛(观察变色圈大小)，最后经摇瓶复筛(测酶活力大小)，具体的配方及操作参照文献[9]。将分离到的菌株用法国梅里埃微生物鉴定仪鉴定，然后进行酶活测定。
1.3 天然菌基因组提取的优化
运用了试剂盒法、酚-氯仿法、煮沸法三种方法分别提取金黄色葡萄球菌全基因组，并经PCR扩增脂肪酶基因[10]，比较三种方法的优缺点，为后续实验提供一定的基础。
1.4 脂肪酶基因的克隆
根据NCBI上公布的一些常见的细菌脂肪酶基因设计了8对通用引物（见表1）。
用8对引物分别对分离出的菌株进行脂肪酶基因的扩增。PCR反应条件I为：94 ℃预变性5 min，再循环30次：94 ℃变性55 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸150 s，最后1个循环72 ℃延伸10 min，适用于引物3、5、8的扩增。PCR反应条件II为：94 ℃预变性5 min，再循环30次：94 ℃变性55 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，最后1个循环72 ℃延伸10 min，适用于引物1、2、4、6、7的扩增。PCR反应体系为50μL体系。PCR产物用经试剂盒纯化，用T4连接酶于与pMD18-T Vector，16 ℃连接2 h后，转化感受态E.coli DH5α细菌，再将少许菌液涂布在含有X-Gal，IPTG，Amp的L-琼脂平板培养基上培养，进行蓝白斑筛选验证试验。
1.5 pMD18-T Vector重组载体鉴定
挑取上步骤中单个白色菌落扩大培养，提取质粒[11]，双酶切电泳鉴定。同时将单个白色菌落的菌液送上海生工测序。
1.6 脂肪酶测序分析及二级结构预测分析
运用软件CodonCode Aligner分析测序结果，SPSS 11.0统计学软件对其进行统计分析，通过在线免费软件PredictProtein分别对人工分离到的金葡菌脂肪酶和NCBI上注册号EU310372脂肪酶进行二级结构预测分析[12]。
2 结果
2.1 产脂肪酶天然菌株的筛选
经过初筛、复筛培养，分离出4株活性较高菌株，经过法国梅里埃微生物鉴定仪鉴定，2株为霉菌，1株为适应弱碱性环境的金黄色葡萄球菌（见图1A，1B），1株为蜡样芽孢杆菌。经过富集、初筛、复筛等过程，用溴甲酚紫平板从富含油脂的土壤中筛选得到产脂肪酶的菌株，大部分酶活力经测定后在20 U/mL以内（见表2）。并对其中的4株的酶学特性做了初步研究，4株的作用温度都较高，在42 ℃左右，一株为产弱碱性脂肪酶，另3株为产弱酸性脂肪酶。
2.2 天然菌基因组提取的优化
所提供的三种提取方法提取全基因，提取效果见图2。泳道1和3试剂盒法、酚-氯仿法所提取DNA电泳条带清晰，泳道2煮沸法提取DNA电泳条带几不可见，表明试剂盒法、酚-氯仿法方法提取的DNA得率较高，煮沸法提取的DNA得率较低。
2.2 脂肪酶基因的克隆与鉴定
不同方法提取细菌基因组后的PCR扩增电泳见图3泳道1～3，表明泳道1试剂盒法最佳，泳道2酚-氯仿法次之，泳道3煮沸法提取的基因组模板的PCR产物出现拖尾现象，可见该方法导致基因组降解较剧烈，完整目的基因也因此保留较少。图3泳道4，为质粒提取试剂盒提取细菌总质粒为模板的PCR产物，无任何扩增条带出现表明该菌脂肪酶基因位于染色体基因上，质粒不携带脂肪酶基因。克隆工程菌重新提取重组质粒，重组质粒用NcoI，XhoI双酶切后得到脂肪酶基因大小约为900 bp，与预期结果一致，见图4。
2.3 测序结果分析
通过Blast比对分析，没有找到与之完全匹配的序列。测序结果与GenBank注册号EU310372的序列同源性较高。测序结果表明有10处碱基变异，导致三处氨基酸发生改变，即56位由缬氨酸变为精氨酸，183位由亮氨酸变为苏氨酸，287位由组氨酸变为谷氨酰胺（见图5）。
2.4 脂肪酶结构预测分析
运用DNA star 7.1软件分别对两个脂肪酶蛋白的二级结构进行分析，比较了各类氨基酸数目，螺旋（H=helix）、折叠(E=extend/sheet)、转角(L=loop)结构的出现的频率（见表3），虽然有一定的变化，但经SPSS 11.0统计学软件对两组酶相应结构类型进行配对t检验统计，无显著性差异（P &>0.05)。图6中箭头所示为标准序列（A）与克隆脂肪酶氨基酸序列（B）第56位氨基酸发生突变位点导致亲水性的显著提高，183位及其287位氨基酸突变对亲水性的影响不显著。
3 讨论
3.1 高产酶菌的筛选及其鉴定
由于含有脂肪酶基因的细菌会进行油脂分解代谢，在高油脂环境中的细菌相应的脂肪酶基因也会有较高的活力及其表达量，故我们选取长期富含油脂的土壤标本分离细菌，这样可以最大可能地保证待筛选菌株含我们所需高活力脂肪酶基因。实际采集中，从餐饮店后方的清洗处的土壤中分离到较多种类的细菌，结合微生物学对细菌形态描述与菌种鉴定，其中就含有多株产高活力脂肪酶的菌株包括葡萄球菌、芽孢杆菌、假单胞菌、霉菌等。
3.2 脂肪酶基因克隆及酶活力测定
根据GenBank中提交的各类脂肪酶基因，设计引物的数量大于分离到的菌株数量，对分离到的菌株进行不同引物条件的扩增，提高了获得脂肪酶基因的可能性，达到预期的目的，得到脂肪酶基因。
在提取微生物基因组中我们开始时采用煮沸法。该法操作简便，成本也很低，但是其基因组得率低，经PCR扩增后得不到产物，尤其对细胞壁较厚的金黄色葡萄球菌等扩增效果不理想，其原因可能是提取的DNA产物不纯，混杂有许多蛋白质，导致后续的PCR扩增无明显结果。因此，试验中先后采用了基因组提取试剂盒和酚、氯仿方法提取基因组取得了较好的效果。用基因组提取试剂盒提取的DNA得率及其纯度都较高，但是成本较高。酚-氯仿法是试验中常规的一种提取细胞染色体DNA的方法，成本较低，但是步骤繁琐，耗时很长，DNA经过多种有机溶剂多次抽提损失较大且易被污染，试剂的有效与否也会产生影响，而且酚和氯仿都对人体有一定的危害[10]。
3.3 克隆脂肪酶二级结构变化讨论
克隆脂肪酶的三处氨基酸突变可能是筛选出含该天然酶细菌活性提高、耐受40 ℃高温以及在高油脂环境依旧水解脂肪的重要原因。而克隆的脂肪酶三处突变导致的结果是亲水性的显著提高，可能有利于提高该酶对脂肪的水解率。
对产脂肪酶的天然菌的分离过程由于是在暑期进行，土壤中油脂来源于生活生产的废弃用油，沉积过程中油的温度可高达60 ℃以上，那些不耐高温且脂肪利用率低的细菌死亡，仅耐高温且产脂肪酶活力高的菌株得以生存。在这种高温、高油脂的外界压力筛选下，微生物的脂肪酶基因极有可能发生突变以适应周围环境。
本实验从细菌中克隆的脂肪酶基因经过BLAST比对后无完全相同基因型，极可能是该微生物在高油脂环境的压力下，其脂肪酶基因发生突变导致其脂肪酶活力的提高，以便于更好利用这一营养物质而能生存下来。后续的研究中我们将进一步在原核表达系统中验证所分离的脂肪酶基因具有高活力，从而获得具有较高热稳定性及其活力的脂肪酶用作各种产品的添加剂及其催化剂。
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