作者：雷培培，叶财学，杨徐一，金利泰，李校
【摘要】 目的 ：运用蛋白质组学方法比较正常与糖尿病性大鼠心肌缺血再灌注损伤时心肌蛋白质组表达图谱的差异。方法 ：将SD大鼠随机分为心肌缺血再灌注组(IR组)和糖尿病心肌缺血再灌注组(DMIR组)。分别取各组左心室心肌蛋白进行二维电泳及凝胶染色后，用ImageMaster 2D Platinum 软件对获得的蛋白图谱加以分析，寻找差异蛋白点。结果 ：二维电泳结果显示，IR组心肌蛋白二维电泳图谱与DMIR组相比共有29个显著差异点，其中6个点表达上调，6个表达下调，17个表达不匹配。结论 ：IR组与DMIR组大鼠心肌的二维电泳结果显示蛋白表达图谱有明显差异，但其差异蛋白为何种蛋白、起何种功能需要进一步的质谱数据进行分析。
【关键词】 心肌缺血;再灌注损伤;糖尿病;蛋白质组
Abstract: Objective: To analyze the differential expression of myocardial proteins of diabetic and non-diabetic rats with myocardial ischemia-reperfusion injury. Methods: Rats were randomly assigned to myocardial ischemia-reperfusion group (IR group) and diabetic myocardial ischemia-reperfusion group (DMIR group). The left ventricular myocardial protein was extracted and two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-DE) was followed with ImageMaster 2D Platinum software analysis in order to find the differences of the protein spots. Results: The result of two-dimensional electrophoresis showed that there were 29 protein spots expressed differently， of which 6 spots showed high expression， 6 spots showed low expression and 17 spots only expressed in IR group. Conclusion: There are significant differences between the myocardial protein expres-sion of IR group and DMIR group， but what’s the differential proteins and which role they played is still needed to further analyse by mass spectrometry.
Key words: myocardial ischemia;reperfusion injury;diabetic;proteomic
糖尿病高血糖可导致多种器官的长期损害和严重的并发症，其中心脏是高血糖损伤的关键靶目标。美国的一项研究显示， 糖尿病心肌病的发生率为0.76%[1]。据统计大约65%～70%的糖尿病患者死于心脏疾病[2]，且以心肌缺血较为常见。统计表明，相同年龄的患者糖尿病心血管疾病导致的死亡比普通心血管疾病高2～5倍。不仅仅心血管疾病在糖尿病患者中较普通患者更常见，糖尿病性心肌缺血患者甚至比非糖尿病患者预后差[3]。二维电泳技术是蛋白质组学研究的核心技术之一，它利用了蛋白质等电点和分子质量的不同来分离复杂蛋白质组分，具有较高的分辨率和灵敏度，目前已成为复杂蛋白质组分检测和分析的一种强有力的生化技术。本研究使用二维电泳对大鼠心肌蛋白进行分离，获得心肌缺血和糖尿病心肌缺血大鼠的心脏蛋白表达图谱差异，从蛋白质水平研究心肌缺血和糖尿病心肌缺血的差异，为研究糖尿病和心肌缺血的关系奠定了一定的基础。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 主要仪器：稳步型血糖仪(美国强生公司);MP150多导生理信号记录仪(美国BIOPAC公司);DN-2000型动物人工呼吸机(上海嘉鹏科技有限公司);超声波细胞粉碎机(宁波新芝股份有限公司);IPGphor TM Ⅲ等电聚焦仪器(美国GE公司);DYY-6C 电泳仪(北京六一仪器厂);脱色摇床(北京六一仪器厂);冷冻台式高速离心机(德国eppendorf公司);SDS-PAGE垂直电泳仪(美国GE公司);Powerlook 2100XL扫描仪(美国UMAX公司)，ImageMaster 2D platinum 6.0图像分析软件(美国GE公司)。
1.1.2 主要试剂：美国强生稳步型血糖试纸、2，3，5-氧化三苯基四氮唑(TTC)、IPG 预制胶条、IPG buffer购自GE公司;链脲佐菌素(STZ)、丙烯酰胺、甲基双丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)、尿素、硫尿、过硫酸铵(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(N，N，N’，N’-Tetramethylethylenediamine，TEMED)、低分子量标准蛋白均购自Sigma公司，3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐;(3-(3-(Cholamidopropyl) dimethylammonio)propanesul-fonate，CHAPS)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺进口分装，BCA蛋白浓度试剂盒购于碧云天生物技术研究所;UPD-蛋白质染料染色试剂盒购于温州安得森生物科技有限公司。
蛋白裂解液：8 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲， 4% CHAPS，2% IPG buffer，40 mmol/L DTT，0.14% PMSF。再水化液：8 mol/L 尿素，2% CHAPS，0.5% IPG-buffer，DTT 2.8 mg/mL，0.25%溴酚蓝。平衡储存液：0.05 mol/L，Tris HCl(pH 8.8)， 6 mol/L尿素，30%甘油，2% SDS，0.25%溴酚蓝溶液。
1.2 方法
1.2.1 动物模型制备：取32只健康雄性SD大鼠，其中16只大鼠造糖尿病模型(一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg体重)，1周后，裁尾取血用强生稳步型血糖仪进行血糖浓度测定，造模成功8周后再做心肌缺血再灌注模型，即DMIR组。其余16只通过胸骨正中切开结扎左冠状动脉前降支(LAD)造模型，即IR组。心肌缺血再灌注模型成功后，两组分别取8只用于2，3，5-氧化三苯基四氮唑(TTC)染色，梗死区域呈现白色或灰白色，非梗死区染成砖红色，用称重法计算梗死面积，其余大鼠用于二维电泳分析。
1.2.2 蛋白质提取：取左心室200 mg，冰浴研磨10 min，加蛋白裂解液3 mL，应用超声细胞破碎仪将其进一步破碎，12 000 g离心20 min，取部分上清用BCA试剂盒测蛋白浓度，其余上清分装于Eppendorf管中，置于-80℃以备用。
1.2.3 等电聚焦：250μL再水化液中加样品60μg，混匀，12 000 g离心20 min，取250μL上清加入胶条槽中，将IPG胶条胶面向下轻放入胶条槽中，使得胶条的正极对应于聚焦盘的正极。加上覆盖油，确保胶条与电极紧密接触。在Ettan IPGphor等电聚焦仪上进行等电聚焦(IEF)，温度20 ℃，再水化8 h，40 V 1 h，100 V 1 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，5 000 V 1 h，8 000 V 7 h，500 V 任意小时。
1.2.4 胶条的平衡及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：取平衡储存液10 mL加DTT 100 mg，加入IPG胶条，轻摇15 min，另取平衡储存液10 mL加碘乙酰胺250 mg，轻摇15 min。
将胶条转移至预先配置好的浓度为10.6%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，首先以10 mA/胶条恒流电泳30 min，使蛋白进入分离胶中;随后以20 mA/胶条电泳约4 h，待溴酚蓝迁移到胶的底部边缘即可结束电泳。
1.2.5 染色：二维电泳后用UPD-蛋白质染料染色试剂盒(温州安得森生物科技有限公司)进行染色。固定：电泳结束后，取凝胶放入50 mL固定液中，在摇床上室温摇动30 min，摇动速度约为40 r/min。染色：在50 mL染色液中染色30 min。脱色：在50 mL固定液里脱色30 s。水洗：在50 mL去离子水中水洗5 min，观察蛋白斑点[4]。
1.2.6 图像扫描与分析：采用光密度透射模式扫描，光学分辨率采用全彩RGB和300 dpi，以TIF格式保存图像，采用专用图像分析系统(ImageMaster 2D plati-num 6.0)进行图像分析，包括蛋白点的检测、蛋白点修正、背景消减、分子量和等电点的校正。然后以模型组心肌组织蛋白的凝胶图像作为参考胶，其他各组与之匹配，采用软件自动匹配并结合人工匹配方式进行。设定表达量相差2倍以上为差异表达范围，给出差异表达蛋白质点的数据信息。
2 结果
2.1 血糖浓度与心肌梗死范围 两组大鼠血糖浓度差异有显著性(P
2.2 二维电泳图 二维电泳结果如图1所示，pH值范围为3～10，分子量范围为10～200 kD的图中可见大鼠心肌蛋白主要在pH范围5～9区间呈均匀分布状态，两组蛋白斑点有一定相似性但差异明显。
2.3 斑点的检测 经软件分析，糖尿病心肌缺血与正常心肌缺血大鼠心肌蛋白表达如图2所示，共有29个明显差异斑点。与正常心肌缺血大鼠相比，糖尿病心肌缺血大鼠蛋白斑点6个表达上调，6个表达下调，表达不匹配的达17个(局部放大图见图3)。蛋白斑点多数集中在等电点pI=5～9范围内，分子量范围在45～97 kD内差异点较多。
3 讨论
随着基因组数据库的不断完善和蛋白质组学技术的不断发展，已有越来越多的研究者将蛋白质组学运用到心血管疾病研究中，即运用二维电泳技术、质谱等手段来观察心肌缺血、高血压、心肌肥大、心衰、心肌梗死导致的心肌细胞蛋白质表达水平和翻译后修饰(PTM)的改变，对这些急慢性心血管疾病的分子机制给予独特的解释。因为心血管系统的功能改变来自于心肌及血管系统(包括平滑肌和内皮细胞)的蛋白质的变化，这些变化可以通过蛋白质组学的手段来证明[5]。目前有一些对于心血管疾病和糖尿病心血管疾病的研究，都是在临床、信号通路方面的研究[6-8]，但在蛋白质组学方面未见相关报道。本实验运用二维电泳的手段初步研究了糖尿病对心肌缺血再灌注损伤的影响，发现了一些差异蛋白，这些心肌蛋白表达的变化可能作为糖尿病或糖尿病心脏损伤的某些生物标志物，这些结果对于深入了解心功能不全和糖尿病性心肌病的细胞和分子机制，奠定了一定的基础。由于本次研究还不能确定相关差异蛋白的种类与功能，因此目前还不能分析本实验得出的差异蛋白究竟发挥了什么样的作用，只有对上述蛋白进行鉴定后我们才能作出合理的解释，因此本实验的后续工作还要进行MALDI-TOF-MS鉴定并通过生物信息学分析上述蛋白所起的作用。
参考文献
[1] Bertoni AG， Tsai A， Kasper EK， et al. Diabetes and idio-
pathic cardiomyopathy: a nationwide case-control study[J].
Diabetes Care， 2003，26(10):2791-2795.
[2] Grundy SM， Benjamin IJ， Burke GL，et al. Diabetes and car-
diovascular disease: a statement for healthcare profession-
als from the American heart association[J]. Circulation，
1999，100(10):1134-1146.
[3] Miettinen H， Lehto S， Salomaa V. Impact of diabetes on
mortality after the first myocardial infarction. The
FINMONICA Myocardial Infarction Register Study Group
[J]. Diabetes Care， 1998，21(1):69-75.
[4] Jin LT， Li XK， Cong WT，et al. Previsible silver staining
of protein in electrophoresis gels with mass spectrometry
compatibility[J]. Anal Biochem， 2008，383(2):137-143.
[5] 钱晓晓， 雷天落， 李学军. 蛋白质组学在心血管研究中的应
用[J].基础医学与临床， 2003， 23 (2):119-125.
[6] Bcklund T， Lakkisto P， Palojoki E，et al. Activation of
protective and damaging components of the cardiac renin-
angiotensin system after myocardial infarction in experi-
mental diabetes[J]. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst，
2007，8(2):66-73.
[7] Karlsson F， Modica A， Mooe T， et al. Dynamics of platelet
activation in diabetic and non-diabetic subjects during the
course of an acute myocardial infarction[J]. Thrombosis
Research， 2007， 121(2):269-273.
[8] Helfenstein T， Fonseca FA， Relvas WG，et al. Preva-lence of
myocardial infarction is related to hyperhomo-cysteinemia
but not influenced by C677T methylen-etetrahydrofolate
reductase and A2756G methionine synthase polymorphisms
in diabetic and non-diabetic subjects[J]. Clinica Chimica Acta，
2005，355(1-2):165-172.