明志胶囊对老年痴呆大鼠学习记忆及脑皮质Bcl-2和Bax基因表达的影响

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论文字数:**** 论文编号:lw2023117324 日期:2025-10-05 来源:论文网

     作者:楚生辉,潘建春,刘敏,胡淑平,于晓敏

【摘要】 目的 :探讨明志胶囊对老年痴呆(AD)大鼠行为学及脑皮质Bcl-2和Bax基因表达的影响。方法: 采用D-半乳糖老年痴呆大鼠模型,分明志胶囊大、小剂量治疗组、脑复康对照组、老年大鼠模型组和老年大鼠空白对照组,检测大鼠行为学及脑皮质Bcl-2和Bax基因表达指标的改变。结果:模型组与空白组相比,学习记忆能力显著下降,Bcl-2/Bax比值下降;治疗组与模型组相比,学习记忆能力显著改善,Bcl-2/Bax比值增加。结论:明志胶囊具有较好的治疗AD作用,其机制可能与促进AD大鼠脑皮质海马区Bcl-2的表达、降低Bax的基因表达有关。

【关键词】 老年性痴呆;明志胶囊;学习记忆;Bcl-2;Bax

  Abstract: Objective: To explore the effect of MingZhi capsule on AD rat in ethology and on expression of Bcl-2 and Bax in brain tissue. Methods: The D-galactose AD rat model was used, and the rats were pided into high and low MingZhi capsule treating group, Piracetam control group, aging rat model group and aging rat blank group. Changes of ethology, expression of Bcl-2 and Bax in brain tissue were tested. Results: AD model might decrease cognitive ability, the ratio of Bcl-2/Bax in the hippocampus comes down. MingZhi capsule significantly alleviated cognitive ability,the ratio of Bcl-2/Bax rises. Conclusion: The results show that the curative effect of MingZhi capsule is good to AD,the expression of bcl-2 protein is increased, while the expression of bax protein is reduced. which may be one of the mechanisms of MingZhi capsule to prevent and treat AD disease.

  Key words: AD;MingZhi capsule;cognitive ability;Bcl-2;Bax

  阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)又称老年性痴呆,是发生于老年前期或老年期的以进行性痴呆为主要表现的神经退行性疾病,其显著特征是严重的记忆丧失和个性改变,患者生活不能自理,寿命明显缩短[1]。其病因病理尚未完全阐明,目前缺乏有效的西医治疗措施,因此发挥中医药优势,研究中药复方在该病中的治疗作用十分必要。本研究拟以中药复方——明志胶囊为载体,通过对老年痴呆大鼠模型的干预,探讨该方对老年痴呆大鼠行为学及脑皮质Bcl-2和Bax基因表达的影响。

  1 材料和方法

  1.1 材料

  1.1.1 动物:健康13个月龄SD大鼠60只,体重(250±20)g,由温州医学院实验动物中心提供。

  1.1.2 药品、试剂及仪器:明志胶囊浓缩液由温州医学院药剂学教研室提供,原药材购于温州医学院附属第一医院药房,经该院药剂科主任林观样鉴定为正品药材,符合部颁或国家标准。原方组成:黄芪20 g、西洋参10 g、当归15 g、川芎15 g、枸杞子10 g、三七粉10 g、远志10 g、菖蒲15 g、首乌10 g、淫羊藿10 g。综合各味药的现代研究资料,工艺设计为:①方中三七和西洋参粉碎入药。②提取川芎、当归、菖蒲所含挥发油。③其余各味水煎,以淫羊藿苷、三七皂苷、黄芪甲苷的含量为指标,筛选水提工艺的参数,经过预试验,用11倍量水提取3次,分别2.5 h、2 h、1.5 h。将上述所得提取液与提取挥发油后的药液混合,浓缩、干燥,将挥发油用β-环糊精包合加入,考察适当的辅料制成胶囊剂,浓度为12.5 g/kg,置冰箱备用;脑复康,天津今世制药有限公司生产,批号:20050346;D-半乳糖,北京化学试剂公司生产,批号:020827;Bcl-2和Bax试剂盒,购自天津灏洋生物制品科技有限公司。Morris水迷宫系统DMS-2为中国医学科学院药物所产品;生物显微镜BH-2为日本Olympus产品。

  1.2 实验方法

  1.2.1 动物模型制备:动物适应性喂养1周后,经水迷宫检测去掉反应过快或过慢者,大鼠按随机数字法分为空白对照组(10只)与造模组(50只)。参照文献[2]的方法,大鼠每日背颈部注射D-半乳糖80 mg/kg(0.1 mL/100 g),连续30 d。空白对照组背颈部皮下注射生理盐水0.1 mL/100 g。

  1.2.2 分组与给药:造模后进行Morris水迷宫定位航行训练。以造模后空白组大鼠逃避潜伏期的均值为参考值,计算造模后30 d每只大鼠平均逃避潜伏期值,如大鼠平均逃避潜伏期值与参考值之差占该鼠平均逃避潜伏期值的20%以上,为造模成功。造模后选造模成功41只,随机分为痴呆模型组(11只)、明志胶囊低剂量组(10只)、明志胶囊高剂量组(10只)、阳性对照组(10只)。空白对照组及痴呆模型组灌胃给予0.9%生理盐水1 mL/100 g,痴呆低剂量组给予明志胶囊药液0.66 g/100 g,痴呆高剂量组加倍,给予明志胶囊药液1.32 g/100 g,阳性药对照组给予脑复康药液0.07 g/100 g。每日1次,连续30 d。

  1.3 主要观测项目及测定方法

  1.3.1 AD大鼠学习记忆功能测定。参照文献[3]应用Morris水迷宫法。Morris水迷宫包括一个直径为120 cm的盛有水的圆形水池,隐藏于水面下1.5 cm(直径为10 cm)平台,平台置于第三象限中央,并有图像自动采集系统进行自动跟踪分析并记录各种参数。水温控制在(24±2)℃,试验人员及周围环境保持恒定,照明四周对称。实验于造模前、造模后、给药后各进行一次,每次为期2 d,并于最后一次定位航行后进行空间探索实验。

  1.3.2 AD大鼠凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的测定。

  1.3.2.1 在行为学测试结束后,进行脑组织取材,脑组织取材方法[3]:大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠(40 mg/kg体重)麻醉,常规胸腹联合切口,经左心室插管,依次用Ringer液,4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液200 mL灌注固定大鼠,注毕取脑,在40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4)的固定液中固定过夜,再分别置于4 ℃150 g/L、300 g/L的蔗糖PBS中,待分别下沉,冰冻切片机冠状连续切片,切片厚度20μm,然后将切片贴于载玻片,保鲜膜封闭片盒,-20 ℃保存。

  1.3.2.2 免疫组化测定步骤[4]:①用PBS-TX洗3次,每次5 min;②滴加正常血清封闭液,室温1 h;③每张切片加入第一抗体100μL(羊抗鼠Bax、Bcl-2,1:100稀释),4 ℃过夜;④PBS-TX洗3次,每次5 min;⑤每张切片加入100μL生物素化的兔抗羊IgG(1:200稀释)室温2 h,PBS-TX洗3次,每次5 min;⑥加入辣根酶标记链亲合素,室温1 h;⑦DAB显色:1 mL蒸馏水加DAB显色剂A、B、C各1滴,显色5~20 min;⑧乙醇脱水,二甲苯透明后中性树脂封片。镜下观察,黄色为免疫组化阳性细胞。计数阳性细胞,各组间比较。

  1.4 统计学处理方法 采用单因素方差分析。

  2 结果

  2.1 明志胶囊对老年痴呆大鼠学习能力的影响 从大鼠入水开始到找到隐藏在水面下平台的时间为逃避潜伏期,以逃避潜伏期时间的长短代表大鼠的学习能力。造模前,各组大鼠的逃避潜伏期相近(P&>0.05)。造模后,造模组逃避潜伏期明显较空白组长(P&<0.05)。给药后,明志胶囊大、小剂量组与阳性对照组较模型组明显缩短(P&<0.05),明志胶囊大、小剂量组与阳性对照组逃避潜伏期相近(P&>0.05),结果见表1。

  2.2 明志胶囊对老年痴呆大鼠记忆能力的影响 定位航行结束24 h后行空间搜索实验。模型组在目的象限停留时间、有效区停留时间、平台停留时间较其他组明显缩短(P&<0.05),结果见表2。

  2.3 明志胶囊对老年痴呆大鼠脑皮质Bcl-2和Bax基因的表达 Bcl-2、Bax蛋白表达结果:光镜下见阳性细胞胞浆内出现棕黄色颗粒,各组均可见免疫组化染色的阳性表达细胞。每组取8个切片,每个切片随机取5个视野,400倍光镜下计阳性细胞数,取平均值进行统计分析。经单因素方差分析及LSD-t检验,空白组Bcl-2、Bax有少量表达,与空白组相比,各组Bcl-2、Bax表达均显著增强(P&<0.05),模型组Bax变化显著,Bcl-2/Bax的比值降低(P&<0.05),治疗组Bcl-2变化显著,Bcl-2/Bax的比值增高(P&<0.05)。明志胶囊大、小剂量组与阳性对照组组间差异无显著性(P&>0.05),结果见表3。

  3 讨论

  AD是一发病机制尚未完全明确的疾病。D-半乳糖可致大鼠亚急性衰老,因此D-半乳糖大鼠模型可以很好地模拟出AD患者的病理生理及行为学表现。而AD在中医学属“呆病”范畴,该病主要与脏腑功能失调、气血运行失常有关,而肾为五脏之根,生髓通脑,故肾虚为本病发病之本,继而因虚致瘀,因虚生痰,痰瘀互阻日久化毒,虚、瘀、浊、毒恶性循环,形成有害网络,损伤脑络,败坏脑髓,成为AD发病的根源[5]。我们以此为依据创制了中药复方——明志胶囊,方中黄芪、西洋参补气,黄芪大补元气,使气旺以促血行,祛瘀而不伤正;当归、川芎、三七粉等活血。当归活血养血,有祛瘀而不伤血之妙;首乌补肝肾、益精血。诸药合用共奏益气活血、醒脑开窍之功,显示出对痴呆治疗的应用前景。

  AD患者在临床表现中最主要的一点是进行性的学习记忆能力减退,尤以近事记忆为主。Morris水迷宫主要应用在学习记忆的神经生物学机制探讨和神经药理的研究。定位航行实验主要考察学习能力,空间搜索实验是对其记忆能力的直接检测。Morris能提供较多的参数,可更全面地考察动物的认知过程,可排除尿液、粪便气味等对实验结果的影响,客观反映其认知能力;操作简便,数据记录准确,误差小。本实验显示,造模后模型组认知能力较空白组明显下降,治疗后,各给药组与模型组比较认知能力明显改善,表明明志胶囊可改善AD大鼠的学习记忆能力。

  AD中神经细胞的死亡主要以凋亡为主。凋亡,又称程序性死亡,受多种凋亡蛋白的调控。Bcl-2蛋白是Bcl-2原癌基因的编码产物,是一种抗凋亡蛋白,能够阻止细胞色素C从线粒体释放到细胞质,从而抑制细胞的凋亡。研究显示,Bcl-2在AD患者脑中明显下调。Bax蛋白是一种Bcl-2家族的前凋亡蛋白,可促进细胞凋亡[6-7]。Bcl-2/Bax的比值决定了细胞是否发生凋亡。造模后,在机体的一种自我保护机制下,Bcl-2蛋白表达反应性增强,同时启动了凋亡程序,Bax表达增强,Bcl-2/Bax的比值下降,促进细胞凋亡的发生。药物干预后,Bcl-2表达增强,Bax表达减弱,Bcl-2/Bax的比值增高,抑制细胞凋亡,表明明志胶囊可抑制细胞凋亡。

  本研究提示,中药明志胶囊对AD大鼠脑神经细胞的保护作用可能是通过上调Bcl-2蛋白、下调Bax蛋白的表达,抑制细胞凋亡而实现,从而改善AD大鼠的学习记忆能力,对AD的防治具有现实意义,但具体机制有待于进一步研究。

参考文献


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  [5]中国防治认知功能障碍专家共识专家组.中国防治认知功能障碍专家共识[J].中华内科杂志,2006,45(2):171-173.

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  [7]Gong C, Boulis N, Qian J, et al. Intracerebral hemorrhage induced euronal death [J]. Neurosurgery,2001,48(6): 875-883.

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