【摘要】 目的 观察Ⅳ型胶原在生后小鼠肾脏发育过程中的表达规律，探讨Ⅳ型胶原在小鼠肾发育成熟过程中的作用。方法 采用免疫组织化学方法检测生后不同日龄小鼠肾组织中Ⅳ型胶原的表达，用细胞图像分析技术和体视学方法对结果进行分析。结果 Ⅳ型胶原表达于生后各日龄小鼠肾脏肾小体、肾小管和集合管的基膜，且随着肾脏的发育成熟，Ⅳ型胶原表达量逐渐增加。结论 在生后肾发育成熟过程中，Ⅳ型胶原表达于基膜存在的部位，可能对基膜的发育成熟起一定的作用。
【关键词】 Ⅳ型胶原 小鼠 肾脏 发育
Abstract: Objective To observe the expression of Collagen Ⅳ in the developing kidney of neonatal mouse and study its function in renal development. Methods The expression of Collagen Ⅳ in neonatal（N）mouse kidneys was examined by IHC， analyzed in a cell image analytical system and stereological method. Results The expression of Collagen Ⅳ can be seen in the basement membrane of glomeruli， renal tubules and collecting ducts. By cell image analytical system and stereological method， the expression of Collagen Ⅳ was found increasing gradually. Conclusions The expression of Collagen Ⅳ was mainly seen in the basement membrane during renal development. It may play an important role in the development of basement membrane.
Key words: Collagen Ⅳ; mouse; kidney; development
1 引言
Ⅳ型胶原与层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、硫酸乙酰肝素和其它大分子交联成网格状结构，共同构成基膜［1］。Ⅳ型胶原是构成基膜的主要蛋白，占基膜干重50％，穿透整个基膜［2］。它通过受体integrin（整合素）和非integrin类的介导，与细胞之间发生粘附反应，直接或间接的控制细胞活动，如粘附或转移，分化和极化，增殖或凋亡及基因表达等，在基膜的形成和稳定中起非常重要的作用［3］。国内外学者对Ⅳ型胶原在肾组织中表达的研究显示，在肾脏发生发育过程中Ⅳ型胶原以一种复杂的动态方式表达于基膜［4］。本实验应用免疫组织化学方法、细胞图像分析技术和体视学方法对生后小鼠肾发育过程中Ⅳ型胶原的表达及其含量变化进行了系统观察和定量分析，为进一步探讨Ⅳ型胶原在肾脏发育成熟过程中的规律及作用提供基本的实验依据。
2 实验材料和方法
2.1 实验动物
昆明小鼠，体重25～30 g， 雌雄各半，供交配用，由辽宁医学院实验动物中心提供。
2.2 主要试剂
Ⅳ型胶原多克隆抗体（SANTA公司提供）。
SABC试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司提供）。
DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司提供）。
2.3 实验方法
2.3.1 动物的培育
选用成年健康昆明小鼠，按雌雄比例1∶1同窝饲养，采用检查阴道栓脱落的方法确定雌鼠受孕时间。以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚0天。记录受孕时间，然后将孕鼠分笼饲养，每日早8时、晚5时观察生产情况，以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后0天。记录出生日期与母鼠同窝饲养。选取生后1天、3天、7天、14天、28天、40天的仔鼠，每组4 只。
2.3.2 标本制备
将生后各龄仔鼠经乙醚麻醉后，于腹后壁取出左肾，用排刀法沿横轴将肾脏切开，入10％中性福尔马林固定3 h，流水冲洗半小时，常规酒精脱水，二甲苯透明，石蜡定向包埋，对各组织块作厚为5 μm的连续切片，供免疫组织化学染色使用。
2.3.3 免疫组织化学染色
切片常规脱蜡至水，3％ h3O2消除内源性过氧化物酶活性，经pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液抗原热修复，滴加正常山羊血清封闭液、一抗（1∶100）过夜后，滴加生物素标记的二抗37℃孵育30 min，滴加SABC37℃孵育30 min后DAB显色，苏木素复染核，常规脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。上述各部均用PBS缓冲液冲洗。用PBS代替一抗作阴性对照。阳性表达为肾小体、肾小管和集合管的基膜均呈不同程度的棕黄色。
2.3.4 免疫组织化学染色图像分析
用CIAS-1000细胞图像分析系统对生后各日龄小鼠肾脏免疫组织化学染色结果进行图像分析，以灰度值表示Ⅳ型胶原表达量，灰度值越大表示Ⅳ型胶原表达量越少，染色越浅。
2.3.5 体视学测量
每组动物系统随机选取5 个组织块，每个组织块连续切片后，等间隔选取5 张切片，每张切片在油镜下观察（×1000），按“S”形等间隔选取5个视野，采用方格测试系统，交点计数法测算Ⅳ型胶原在阳性表达部位的面密度值。公式为：Sv = 2Ll= 2 Ix / Lc. (Lc =ΣPc □ a)，式中Ix为阳性表达的部位与测试方格的交点数，Pc为方格系统落在参照系（整个肾组织）的点数，a为方格两点间的距离，相当于实际长度的0.1 mm。
2.3.6 统计学分析
所有数据用±s表示。应用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义。
3 结果
3.1 免疫组织化学结果
生后小鼠肾脏的发生发育仍在进行，Ⅳ型胶原在肾组织中的表达随着肾脏的发育成熟而增加。Ⅳ型胶原在生后发育各个时期的肾小体、肾小管和集合管的基膜均有表达（图1，2）。
3.2 免疫组织化学染色图像分析结果
从N1d到N40d，Ⅳ型胶原表达的灰度值逐渐降低，每个天数与背景染色相比都有统计学意义（P&<0.05），说明Ⅳ型胶原随着日龄的逐渐增加，在肾脏的表达量逐渐增多（表1）。
表1 生后各日龄小鼠肾组织中Ⅳ型胶原总体表达的灰度值（略）
3.3 体视学测量结果
在生后小鼠肾脏发育过程中，Ⅳ型胶原在阳性表达部位的面密度值逐渐增多（表2），说明其表达量逐渐增加。
表2 生后小鼠肾组织中Ⅳ型胶原总体表达的面密度值（略）
经统计分析，每组间数值均有显著性差异，P＜0.05
4 讨论
在生后肾脏发育和成熟过程中，随着基膜的发育和成熟，Ⅳ型胶原分别表达于肾小体内皮细胞的基膜、肾小囊基膜、肾小管（近端小管、细段、远端小管）和集合管的基膜中［5］，推测Ⅳ型胶原在肾小体的发育和系膜区的形成中都起一定的作用，它对肾小囊的发育成熟和肾小管及集合管的发育成熟也起重要的作用。
本实验观察到在肾组织发育成熟过程中，Ⅳ型胶原表达量明显增多，且分布也较广泛，推测它参与诱导肾脏发育的各个阶段，并在肾小体基膜、肾小管基膜等结构的形成、成熟及其形态和功能的维持等方面起广泛的作用。目前已证实至少有6种Ⅳ型胶原α链［6］，具体是哪一个链在何时在哪一个部位表达，还有待于进一步研究证实。
肾小体基膜是滤过屏障的组成部分［7］，肾小管的基膜是维持小管重吸收、分泌排泄和交换功能的基础［8］。本实验观察到在发育各个时期的肾小体、肾小管、集合管的基膜中都有Ⅳ型胶原的较强的表达，推测它对维持肾小体基膜通透性和肾小管正常的分泌重吸收等方面都发挥重要的作用。（此文图1-2见附页7）（略）
参考文献
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［4］ 黄松明，蔡毅，费莉，等.细胞外基质在胚胎和成熟肾组织中的表达［J］.中华儿科杂志，1998，36（4）：205.
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［6］ Jarad G， Cunningham J， Shaw AS，et al. Proteinuria precedes podocyte abnormalities inLamb2-/- mice， implicating the glomerular basement membrane as an albumin barrier［J］.Clin Invest， 2006，116(8):2272-2279.
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