作者：潘月星，金英，隋海娟，张智娟
【摘要】 目的 观察外源性内毒素脂多糖(lipopolysaccharide ， LPS) 作用于大鼠大脑皮层星形胶质细胞（astrocyte，AC）时，NO产生和释放的变化，以及选择性诱导型一氧化氮合酶（inducible nitricoxide synthase， iNOS)抑制剂S-甲基异硫脲(S-methylisothiourea，SMT)对其的影响。方法 运用Griess重氮化反应法检测NO代谢产物NO2- / NO3- 来反映正常组、LPS（10 μg/mL）诱导后及加入SMT（1 μmol/mL）的LPS诱导后NO的活性。结果 LPS作用后，AC合成和分泌NO增加，呈时间依赖性，且在24 h增加最明显；SMT能明显抑制LPS诱导AC的NO过分泌（P＜0.001）。结论 在体外培养的AC，LPS可诱导NO的合成和释放增加，该过程主要是通过激活iNOS表达实现的。
【关键词】 星形胶质细胞；脂多糖；iNOS；NO
Abstract：Objective To explore the change of nitric oxide (NO) by LPS in rat astrocytes， and the effect of SMT on it. Methods NO was detected by Griess method in normal astrocytes， LPS (10 μg/mL) induced astrocytes， SMT (1 μmol/mL) added and LPS induced astrocytes. Results NO increased in a time-dependent manner when cells were induced by LPS， especially on 24 h，SMT inhibited the secretion of NO induced by LPS in astrocytes. Conclusions LPS could stimulate the release of NO， which could be down-regulated by SMT remarkably. As a result，we can say the main mechanism that contributes to the accretion of NO secretion might be the activation of iNOS.
Key words:astrocyte; lipopolysaccharide; iNOS; NO
自20世纪80年代内源性NO被发现以来， 其广泛而重要的生理及病理作用已越来越引起人们的重视。1992年Science杂志将NO选为当年的“明星分子”， 以突出其重要性。作为一种不稳定的高度弥散性自由基，NO主要生理作用是作为信号传递物而扩张血管，抑制血小板聚集，以及作为神经元之间的信号传递物等。适量产生的NO可以满足生理功能需要，但产生过多或过少都将导致脑组织的病理性损伤。一氧化氮合酶(NOS)是NO合成的关键酶，同样也引起了神经科学工作者的极大关注。目前， 在生物组织中已经确定的NOS亚型有3种，分别称为神经元型NOS(nNOS/NOS1)、内皮型NOS (eNOS/NOS3)、诱导型NOS (iNOS/NOS2)， 前两者又合称为结构型NOS (cNOS)。cNOS在多种生物效应中发挥作用，它的激活依赖于Ca2+ /CaM (钙调蛋白)。而iNOS一旦合成， 其活性为非Ca2+依赖性， 但其诱导过程则为Ca2+依赖性。iNOS在基态下不起作用， 但iNOS被诱导后活性可持续达20 h，合成nmol水平的NO ，较cNOS 合成的NO浓度高约1 000倍［1］。初步研究表明在3 种类型NOS 中，nNOS 和iNOS 均与神经损伤机制有关，而eNOS 可能有助于防护神经损伤。
现已证明，炎症反应在一系列常见神经变性疾病如阿耳茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)， 帕金森(氏)病(Parkinson’s disease，PD)，肌萎缩性(脊髓)侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，亨延顿舞蹈病(Huntington)以及脑缺血和中风(stroke)等发生发展中扮演着重要的角色，甚至成为很多原发病发展的终极［2］。NO在炎症反应中，既是效应分子，又是第二信使和神经递质。而在CNS，NOS 3种亚型均有其特定分布。脂多糖（LPS）是一种以氨基酸为组成单位的磷脂，构成革兰氏阴性杆菌细胞壁的主要成分，可以作为非特异性免疫刺激物质，引起炎症反应［3］，是研究炎症反应很好的工具。本实验为了探索在LPS所致CNS炎症反应过程中，AC合成和分泌NO的变化及诱导AC过表达NO可能的主要关键酶类型。
1 材 料
1.1 实验材料 出生24 h以内的SD大鼠（辽宁医学院动物实验中心提供），DMEM培养基（Gibco 公司），胎牛血清（华美生物试剂有限公司），多聚赖氨酸、胰蛋白酶（1∶250）、神经胶质酸性蛋白单克隆抗体(glial fibrillary acid protein，GFAP)购于Sigama公司，SMT和一氧化氮试剂盒（碧云天生物技术研究所）。
1.2 细胞培养 无菌条件下取出新生1 d SD大鼠的全脑，剔除软脑膜和血管，剪碎，加入0.125%的胰酶溶液消化，过滤，离心(1 000 rpm，10 min)，用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，调整细胞密度，以5×105/mL的密度接种于经10 μg∕mL多聚赖氨酸处理的75 cm2培养瓶中。置于37℃、5%CO2孵箱中培养，以后每3 d换液1次，第9天将培养的星形胶质细胞置于恒温摇床上，37℃、260 rpm、20 h，移去培养基，仍贴壁的细胞大部分为星形胶质细胞，用0.25%胰酶消化后离心，用完全培养其重悬，接种于两个75 cm2培养瓶中，以传代。如此，传至两到三代后进行试验。
2 方 法
潘月星，等：脂多糖对大鼠大脑皮层星形胶质细胞分泌NO的影响辽宁医学院学报 2008年12月，29(6)2.1 星形胶质细胞的GFAP染色鉴定 间接荧光抗体染色法：将长有细胞的盖玻片经4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3 次，10 min/次；Triton-100作用30 min，PBS冲洗3次，10 min/次；BSA封闭，4℃过夜1∶200兔抗，室温，1 h，PBS洗3次，3 min/次；1∶200稀释羊抗兔IgG-FITC（Sigma产品），37℃，避光，水浴30 min，PBS洗3次，10 min/次；缓冲甘油封片，最后荧光显微镜下观察细胞。95%以上为星形胶质细胞可进行实验。
2.2 实验分组及NO检测 取培养第3代AC接种于24孔培养板，置培养箱中培养3 d，待细胞增殖融合成单层，换液，加入LPS（10 μg/mL），根据LPS作用时间和有无联合应用SMT（1 μmol/mL）分为LPS作用0、1、2、4、8、16、24、48 h，SMT预处理组即在加入SMT作用1 h后加入LPS作用24 h及单独SMT作用24 h组。于不同时间点收集上层培养基，1 500 rpm，4℃，离心10 min，收集各组上清液，冻存。以NO的稳定性代谢产物——亚硝酸盐作为检测NO的指标，用Griess法试剂盒测定，严格按产品说明书操作。
2.3 数据统计 实验结果采用SPSS11.5软件分析，所有数据以均数±标准差(±s)表示， 采用差异单因素方差分析和SNK进行统计分析，P &< 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 LPS对AC分泌NO的影响 LPS诱导组，随着LPS（10 μg/mL）作用时间延长，NO产生随之增加［24 h时，NO分泌增加明显（19.50±3.08 μmol/L）］，接近饱和，与相同时间对照组（3.38±0.15 μmol/L）相比，差异有明显统计学意义（P＜0.001），24 h之后NO增加不明显(表1)。表1 LPS诱导AC分泌NO随着时间的变化趋势
**P＜0.001，与正常对照组相比
3.2 SMT对LPS诱导AC分泌NO的影响 与LPS诱导组相比，SMT（1 μmol/mL）预处理组有效逆转LPS诱导AC过分泌NO的效应（6.69±0.54)μmol/L，差异有明显统计学意义（P＜0.001）；SMT组与相同时间对照组相比有所下降，但未达统计学意义（图1）。
4 讨 论
在过去的20年里，关于星形胶质细胞主要作为神经元辅助代谢细胞甚至是物质支持细胞的观点已经逐渐淡出人们的的视线。现已知道，这些形似星星的细胞被证实不仅仅作为神经元的支持细胞，而且在神经元发挥功能时扮演着重要的角色。有研究表明，星形胶质细胞除具有支持、营养、调节神经递质、合成神经活性物质等功能外，还具有免疫细胞的功能，与其他外周免疫细胞一样能够分泌、合成炎性细胞因子，表达主要组织相容性复合物（MHC），参与了神经系统疾病的病理过程［4，5］。而另一方面，星形胶质细胞可能通过扩散扩布性抑压或者通过发布促凋亡信号导致组织损伤；星形胶质细胞还可以借参与神经胶质瘢痕的形成来抑制神经元再生。
炎症是众多疾病发展的病理机制，大量研究都表明AC在炎症调控中扮演着重要的角色［6］。在炎症初期充当抗原呈递细胞，并参与炎症启动过程，分泌促炎症细胞因子，如TNFα、IL-1β、IL-6等。在炎症反应中，常以“病理形式”存在的iNOS亦被诱导表达，产生过量的NO，而iNOS介导的NO主要作为细胞毒性和免疫信息分子，具有杀伤、清除和免疫调节作用，同时，也引起组织、细胞损伤等病理过程。临床病理学研究也显示的iNOS的过表达与过量NO产生和炎性介质的大量释放在各病理器官中呈明显相关性， 这提示iNOS及其合成的NO和次级产物活性氮等引发炎症反应， 对炎症相关疾病发生发展起促进作用。
在人类CNS，iNOS主要存在于小胶质细胞、血管平滑肌细胞，然而，星形胶质细胞以数量见长，约占中枢神经系统(CNS) 细胞总数的85%以上，是NO的主要来源。本研究用经典致敏剂LPS作用于AC，以NO的稳定性代谢产物——亚硝酸盐作为检测NO和iNOS活性的指标。结果表明，星形胶质细胞在细菌成分LPS的刺激下，NO产生增加，且呈时间依赖性，至24 h后明显增加。主要是由于体外培养的星形胶质细胞中刺激原的持续存在和无清除NO的场所，因此，NO随时间依赖性增加；而高度选择性诱导型一氧化氮合酶（inducible nitricoxide synthase， iNOS)抑制剂S-甲基异硫脲(S-methylisothiourea，SMT)能显著降低LPS诱导AC的NO的过分泌，暗示了由LPS诱导的AC合成和分泌NO增加主要是通过激活iNOS表达实现的。这为我们应用iNOS抑制剂治疗CNS炎症性疾病提供了新的可靠依据，同时，我们也看到了iNOS抑制剂作为抗炎治疗策略的前景。（此文图1见附页1）
参考文献
［1］ Fortermann U，Closs EI，Pollock JS， et al.Nitric oxide synthase isozymes.Characterization， purification， molecular cloning， and functions［J］. Hypertension， 1994， 23:1121-1131.
［2］ Tzeng SF， Hsiao HY， Mak OT，et al. Prostaglandins and cyclooxygenases in glial cells during brain inflammation［J］. Curr Drug Targets Inflamm Allergy，2005，4(3):335-340.
［3］ Kelly A， Vereker E， Nolan Y， et al. Activation of p38 plays a pivotal role in the inhibitory effect of lipopolysaccharide and interleukin-1β on long term potentiation in rat dentate gyrus ［J］. J Biol Chem， 2003， 278(21):19453 - 19462.
［4］ Montgomery DL. Astrocytes：form，function and roles in disease［J］. Vet Pathol， 1994，31：145-167.
［5］ Chandler LJ， Kopnisky K， Richards E， et al. Angiotensin II decreases inducible nitric oxide synthase expression in rat astroglial cultures［J］. Am J Physiol， 1995， 268:700-707.
［6］ Regunathan S，Piletz JE. Regulation of inducible nitric oxide synthases and agmatine synthesis in macrophages and astrocytes［J］.Ann N Y Acad Sci，2003，1009:20-29.