基质金属蛋白酶-9与层黏连蛋白在原发性干燥综合征唇腺中的表达

【摘要】 目的 探讨基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)、层黏连蛋白(Laminin，LN)在原发性干燥综合征(Primary Sjgrens’s Syndrome，PSS)患者唇腺组织的表达及其与唇腺病理分级的相关性。方法 采用免疫组化S-P法检测59例PSS患者，30例正常对照者唇腺中MMP-9，LN表达。结果 原发性干燥综合征患者唇腺组织中MMP-9高表达，LN低表达，而对照组唇腺组织中MMP-9低表达，LN高表达；MMP-9的表达强度随唇腺病理分级升高而增强，LN的表达随唇腺病理分级升高而减弱；MMP-9与LN的表达呈现负相关性。结论 MMP-9、LN在PSS患者唇腺组织中存在异常表达，并且二者的表达情况与病理分级相关。

【关键词】 原发性干燥综合征 基质金属蛋白酶-9 层黏连蛋白 唇腺

　　Abstract: Objective To study the relationship between MMP9，LN and their roles in the pathogenesis of Primary Sjgrens's Syndrome. Methods Immunohistochemical technique was employed to detect the expression of MMP9 and LN in the labial gland acini of patients with Primary Sjgrens's Syndrome (PSS). Results Significant differences in LN and MMP9 expressions between two groups were found.The expression of MMP9 in the labial gland of the patients with PSS was increased significantly (P＜0.01) and the expression of LN in the labial gland acini of the patients with PSS was decreased significantly (P＜0.01). The expression degree of MMP9 was significantly negatively correlated with the the expressioned degree of LN， and the Pearson's correlation coefficient was0.997 (P＜0.01). Conclusion MMP9，LN may be involved in the pathogenesis of Primary Sjgrens's Syndrome.

　　Key words:Primary Sjgrens's Syndrome; matrix metalloproteinase9; laminin; labial glands

　　原发性干燥综合征(Primary Sjgrens’s Syndrome，PSS)是一种累及全身外分泌腺的自身免疫性疾病，主要侵犯泪腺和唾液腺，以淋巴细胞、浆细胞浸润为特征，可以引起腺体分泌减少，出现眼、口干燥症状。其发生淋巴瘤的机率是正常人的44倍［1］。MMP-9是一个蛋白酶家族中主要成员之一，能降解上皮基底膜(basement membrane，ＢＭ)，在许多生理和病理过程中发挥重要作用，包括免疫和炎症反应。有关MMP-9在肿瘤的发病及MMPs抑制剂对肿瘤和部分自身免疫性疾病治疗作用的研究已有报道［2-3］，而有关MMP-9及LN与PSS的发病机制关系，国内未见报道。深入探讨PSS患者唇腺组织MMP-9的表达及其与LN表达间的关系，有可能为PSS提供新的治疗靶点，本研究应用免疫组化SP法对原发性干燥综合征患者唇腺区MMP-9及LN进行了检测和分析。

　　1 资料和方法

　　1.1 临床资料

　　实验组：2004年5月～2006年9月我科门诊及住院的PSS患者59例，所有病例均符合2002年干燥综合征国际分类诊断标准［4］，首次确诊时由本院口腔科行唇腺活检术。术前均征得患者本人的同意。男3例，女56例，年龄25～65岁，平均(45.46±11.86)岁;病程1个月～10年，平均(2.27±2.91)年。对照组：30例为同期健康志愿者。两组患者年龄、性别等无统计学差异。

　　1.2 方法

　　石蜡5μm厚连续切片，常规处理后，微波炉抗原热修复，依次加入即用型一抗(鼠抗人MMP -9、LN工作液)、生物素标记二抗，DAB显色、苏木素复染。具体操作步骤严格按试剂盒说明进行。用已知阳性片作阳性对照，PBS代替一抗作空白对照。鼠抗人MMP-9、LN工作液和即用型SP免疫组化染色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

　　1.3 结果判断标准

　　免疫组化：光学显微镜下MMP-9以胞质内出现黄色颗粒状物质为阳性，LN以基底膜线性染色为阳性，按着色强弱分级计分:无着色为0，浅黄色为1，深黄色为2，棕黄色为3;着色范围以在40倍镜下随机选取5个视野(每个视野计数100个细胞)计数阳性细胞所占的百分比均值:＜25%为1，25%～50%为2，＞50%为3。上述两项相加即为MMP 9或LN的强度积分:＜3分为阴性，3分为(+)，4分为阳性(2+)，5分为(3+)，6分为(4+)。

　　HE染色按Chisholm标准进行病理分级［5］：0级为间质中无淋巴细胞浸润；1级为每4mm2组织内有少量淋巴细胞浸润；2级为每4mm2组织内有轻度淋巴细胞浸润；3级为每4mm2组织内有中度淋巴细胞浸润或少于一个灶淋巴细胞浸润；4级为每4mm2组织内有两个或两个以上淋巴细胞浸润灶，每个灶至少有50个淋巴细胞聚集。

　　1.4 统计学方法

　　采用SPSS 13.0统计软件，两样本计数资料比较采用非参数秩和检验、单因素方差分析及Pearson相关性分析。

　　2 结果

　　阳性信号为胞浆内出现黄色颗粒。以PBS代替一抗的空白对照切片中，无任何阳性反应。59例原发性干燥综合征患者唇腺组织MMP 9阳性，呈现高表达，主要位于导管细胞胞浆(图1，见封3)。30例原发性干燥综合征患者的唇腺组织检测到LN，呈现低表达(图2，见封3)。对照组唇腺组织中MMP-9表达为阴性或弱阳性，而LN呈现高的表达(图3，见封3)。二组MMP-9、LN的表达强度相比较，差异有统计学意义，并且MMP-9的表达随病理分级的升高而升高，LN的表达随唇腺病理的分级升高而减弱，MMP-9与LN的表达强度呈现负相关(r=-0.997，P＜0.01)，见表1、2。表1 MMP-9、LN在正常对照与患者唇腺中表达强度的比较（略）表2 MMP-9、LN在PSS患者唇腺中表达强度与病理分级的关系（略）

　　3 讨论

　　PSS是临床常见的结缔组织病，发病率仅次于类风湿关节炎。PSS最主要的病理特征是唇腺、泪腺等腺体组织中淋巴细胞的灶性浸润。PSS因外分泌腺结构破坏、功能受损可出现口干、眼干症状，还可有皮疹、关节炎、胆囊炎、胰腺炎、肾小管病变、肺部受损等全身表现，并且PSS发生淋巴瘤的机率明显高于正常人［1］。至今，其确切发病机制仍不完全清楚。唇腺导管、腺泡上皮及基底膜的完整是保证唇腺功能正常的基础。

　　在正常情况下，上皮细胞不但分泌LN等基底膜蛋白以形成基底膜，而且分泌MMP-9等依赖锌离子的内肽酶降解物质分解基底膜，使基底膜成分处于不断合成和降解的动态平衡，以维持基底膜完整结构。PSS的典型唇腺病理特征是导管周围大量的淋巴细胞浸润成灶，并且多为CD4+的T淋巴细胞［6］，MMP-9可以介导T 细胞的迁移［7］。

　　本研究发现MMP-9在PSS患者唇腺组织中高表达，与对照组比较差异明显(Ｐ＜0.01)，并且表达强度随着病理分级的升高而表达增强，具有统计学意义(Ｐ＜0.01)。LN在PSS患者唇腺组织中呈现低表达，表现为基底膜染色减弱、基底膜破坏、断裂甚至缺失，与对照组比较差异明显(Ｐ＜0.01)，并且表达强度随着病理分级的升高而减弱，差异具有统计学意义(P＜0.01)。MMP-9与LN的表达间存在显著性负相关性(r=-0.997，P＜0.01)。部分对照组MMP-9的低表达，推测为其发挥生理作用维持基底膜完整结构。Fox［8］研究认为唇腺组织的上皮细胞具有一定的免疫功能，而在PSS患者的腺体局部免疫失衡的情况下，导管上皮细胞产生MMP-9的增加，LN是MMP-9的作用底物，即MMP-9活性增加，从而导致MMP-9降解其基底膜中的层黏连蛋白，而基底膜借助层黏连蛋白与上皮细胞紧密连接［9］，一旦基底膜结构不完整，二者连接受到影响，导致腺体分泌功能受损。推测PSS患者唇腺功能的受损有MMP-9与LN的参与。
　　
　　本研究结果提示，MMP-9、LN在PSS患者唇腺组织中存在异常表达，并且二者的表达情况与病理分级相关，而检测原发性干燥综合征患者唇腺组织中MMP-9、LN的表达变化，可以预测病变，为临床实施积极的干预措施提供实验室依据。

参考文献

　　［1］张乃峥.临床风湿病学［M］.上海:上海科学技术出版社，1999.290.

　　［2］Zucker S，Cao J，Chen WT.Critical appraisal of matrix metalloproteinase inhibitors in cancer treatment［J］. Oncogene，2000，19:6642-6650.

　　［3］Kerkela E，Saarialho-kere U.Matrix metalloproteinase in tumor progression:focus on basal and squamous cell skin cancer［J］.Exp Dermatol，2003，12:109-125.

　　［4］董怡.2002年修订的干燥综合征国际分类(诊断)标准［J］.中华风湿病学杂志，2002，6(4):257.

　　［5］Chisholm DM，Mason Dk.Labial salivary gland in Sjgren's Syndrome［J］.J Clin Pathol，1968，21:656-660.
　　
　　［6］唐福林.原发性干燥综合征的发病机制［J］. 中华风湿病学杂志，2000，4:50-53.

　　［7］Leppert D，Waubant E，Galardy R，et al.T cell gelationases mediate basement membrane transmigration in vitro［J］. Immunnol，1995，154:437-489.

　　［8］Fox RI，Kang H.Pathogenesis of Sjgren's syndrome［J］. Rheum Dis Clin North Am，1992，18(3):517.

　　［9］刘金丽，张学军.层粘连蛋白研究进展［J］. 国外医学皮肤性病学分册，2000，26(1):352-354.