【摘要】 目的 探讨强力霉素对人肺癌细胞系A549细胞的增殖和体外侵袭能力及其基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响。方法 采用MTT比色法研究不同浓度强力霉素(2.5、5、10、20、50mg/L)对A549细胞增殖的影响，免疫组织化学方法和Millicell-pore小室法，研究不同浓度强力霉素(2.5、5、10、20mg/L)作用后，A549细胞MMP-2蛋白表达及其体外侵袭转移能力的影响。结果 10mg/L以上强力霉素可以抑制A549细胞增殖，5mg/L以上强力霉素可以抑制A549细胞中MMP-2蛋白的表达及体外侵袭。结论 强力霉素可以抑制A549细胞增殖及体外侵袭，其抑制A549细胞侵袭及转移的作用与其抑制MMP-2的表达有关。
【关键词】 肺癌 基质金属蛋白酶 强力霉素 侵袭
Abstract: Objective To study the effects of doxycycline on the proliferation， expression of matrix metalloproteinase-2 (MMP2) and the invasiveness of lung cancer carcinoma cell line A549 in vitro． Methods MTT assay was applied to study the effects of doxycycline（2.5，5，10，20，50mg/L） on the proliferation of A549. Immunohistochemistry stain and millicellpore chamber were used to investigate the expression of MMP2 and the invasive ability of different concentration of doxycycline （2.5，5，10，20mg/L） treated A549 cells． Results Doxycycline more than 10mg/L inhibited the proliferation of A549 in a nose and time dependent manners. Doxycycline more than 5mg/L inhibited the expression of MMP2 and invasivenessn of A549. Conclusion Doxycycline can inhibit the proliferation， invasiveness and metastasis of A549 and the mechanism of which is related to the inhibition of MMP2 in A549 cel1．
Key words: lung cancer；matrix metalloproteinase；doxycycline; invasiveness
肺癌是一种发病率及死亡率极高的恶性肿瘤，对人类健康的危害日益严重。尽管治疗手段在不断发展，肺癌患者的生存时间并没有明显延长。癌细胞的侵袭和转移是影响其疗效的主要原因，因此，寻找有效手段干预癌细胞的侵袭、转移成为肺癌研究的一个重要方向。基质金属蛋白酶因参与了侵袭转移的各个环节，故而成为肿瘤治疗的一个重要靶标。研究表明，在肿瘤侵袭转移中，MMPs不仅可降解细胞外基质，而且可维持肿瘤微环境并促进肿瘤生长［1］、调解细胞粘附［2］、能增强上皮细胞的运动能力［3］，从而参与肿瘤的侵袭转移。还有研究证实MMP-2、MMP-9和MT1-MMP等在血管形成过程中发挥重要作用［4］。细胞外基质金属蛋白酶诱导剂EMMPRIN可以通过刺激MMP和VEGF的表达，促进肿瘤血管形成和肿瘤生长［5］。而强力霉素除了具有广谱的抗菌作用外，还有抑制基质金属蛋白酶的功能［6-8］。本研究采用免疫组化、MTT及Millicell小室法，观察强力霉素对人肺癌细胞系A549细胞表达基质金属蛋白酶2(MMP2)及肿瘤的生长、侵袭和转移的影响，为强力霉素治疗肺癌提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
强力霉素、DMEM、MTT试剂、DMSO均购自Sigma公司；胎牛血清购自康利达生物制品公司；胰酶、Millicell-pore购自美国Costar公司；SABC免疫组化试剂盒及抗MMP-2单抗购自武汉博思德公司； Matrigel为BectonDickinson公司产品。其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养：肺腺癌细胞系A549细胞由第四军医大学口腔生物教研室提供。细胞培养于DMEM培养液中(含100mL／L胎牛血清、100 U／mL青霉素、100mg／mL链霉素)，在37℃体积分数为5％CO2培养箱内培养。
1.2.2 药物对细胞增殖作用的测定：取对数生长期的A549细胞，用0.25g/L的胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，将单细胞悬液以5×104 /mL的密度接种于96孔板，每孔200μL，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养。培养过夜后，分别加入含有不同浓度强力霉素的培养液，终浓度分别为2.5、5、10、20、50 mg/L，对照组加入相同体积的培养液。每一浓度设6个复孔，分别继续培养24、48、72h。实验结束前4h，每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，继续培养4h后，吸弃上清，每孔加入150μL DMSO，振荡15min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上，以波长490nm测定各孔吸光度(A)值。观察强力霉素对A549细胞生长的影响。
1.2.3 Millicell细胞移行实验：将Matrigel以0.5mg/mL的浓度溶于凉蒸馏水中。以每室50μL加入Millicell小室，置超镜台上风干。放入已加入600μL含0.1%牛血清白蛋白的DMEM培养液的下小室，37℃孵育1h取出备用。用胰酶将不同浓度(2.5、5、10、20mg/L)的强力霉素干预48h后的A549细胞消化，重悬于含0.1%牛血清白蛋白的DMEM培养液中，成单细胞悬液，调整细胞计数为1×105/mL，以200μL/室加入Millicell小室，并加入上述浓度强力霉素，对照组不加强力霉素。将Millicell小室置入无菌24孔培养板，室外加入FN的培养基(16μg/室)，每组设4个平行实验孔。继续培养8h后，取出Millicell小室，PBS淋洗，95％乙醇固定，用棉签拭去微孔膜内面的细胞，台盼蓝染色，200倍光学显微镜下计数移至微孔膜下的细胞，10个视野/膜。实验重复3次，取其均值，并计算趋化抑制率。
趋化抑制率＝(1-实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数)×100%。
1.2.4 免疫组化染色检测强力霉素对A549细胞表达MMP-2的影响：取对数生长期A549细胞消化后，以104／孔接种于24孔培养板，细胞爬片，常规更换培养液。细胞生长至密度70％时，将培养液更换成含0、2.5、5、10和20mg/L强力霉素的DMEM条件培养液，继续培养48 h。取出盖玻片，PBS洗2次，95％酒精固定30 min。按试剂盒说明书进行SABC免疫组化染色，一抗工作浓度1∶75。阴性对照用PBS代替一抗，阳性对照为随抗体赠送、已确定为MMP-2阳性的乳腺癌石蜡切片。细胞浆内出现棕黄色者判为阳性。
1.3 统计学方法 检测结果采用SPSS软件行方差分析及t检验。
2 结果
2.1 强力霉素对细胞增殖能力的影响
MTT法检测强力霉素对人肺癌A549细胞生长的影响。结果表明，10mg/L以上强力霉素明显地抑制A549细胞生长，且随着时间延长，该作用加强(F=7360.332，P=0.000)；在一定时间下，这种抑制作用随浓度增加而加强(F=178.670，P=0.000)。即强力霉素抑制A549细胞增殖呈时间、剂量依赖关系(表1)。表1 强力霉素对人肺癌A549细胞生长的影响(略)
2.2 强力霉素对A549细胞侵袭能力的影响
不同浓度强力霉素作用后，A549细胞侵袭Matrigel到达Millicell小室下室面的细胞数见表2(图1，见封2)。可见强力霉素可抑制人肺癌细胞系A549细胞对Matrigel的侵袭力，且随着药物浓度的增高，其抑制作用增强(F=262.530，P=0.000)。与对照相比，2.5mg/L强力霉素的趋化抑制率为12.1%，5、10、20mg/L强力霉素的趋化抑制率分别为47.3%、71.4%、86.8%。表2 强力霉素的A549细胞侵袭力的影响(略)
2.3 强力霉素对A549细胞表达MMP-2的影响
免疫组化结果显示MMP-2蛋白定位于细胞质，细胞膜及核中均无表达。对照组及2.5mg/L强力霉素组的A549细胞MMP-2的表达呈强阳性；5mg/L强力霉素处理后MMP-2的表达明显减弱，10mg/L及20mg/L强力霉素处理后MMP-2表达进一步减少(图2，见封2)。
3 讨论
基质金属蛋白酶(MMPs)是一种锌离子依赖性内肽酶，通过对细胞外基质的分解和诱导新生血管的形成，在恶性肿瘤的生长和转移中起重要作用［9］，因而成为肿瘤研究的一个热点。研究表明，无论在小细胞肺癌还是非小细胞肺癌，都有各种MMPs表达［10］。不同的MMPs在恶性肿瘤发展的不同阶段有着各自不同的作用［11］。其中，MMP-2与肿瘤的关系极其密切，在肺癌的早期转移侵袭中起着尤为重要的作用［12］。
Thomas等［13］报道肺癌组织中MMP-2蛋白含量显著高于正常组织，且在腺癌中的表达较鳞癌明显增强。Gonzales等［14］观察了不同肺癌细胞株中MMP-2的表达和活性，结果显示在小细胞肺癌细胞株MMP-2的表达最高，活性最强。这些均表明MMP-2与肺癌细胞的侵袭转移能力密切相关。
强力霉素是一种四环素类广谱抗生素，多年来一直被用于敏感菌的抗感染治疗。近几年的研究发现，强力霉素还是MMPs的有效抑制剂［15］。Cheung等［16］在探究心肌缺血再灌注损伤中发现强力霉素可以通过抑制MMP-2及其前体而减轻这种损伤。Cakir［17］用强力霉素处理犬的骨肉瘤细胞时可以抑制明胶酶活性。Rose［18］等发现强力霉素可以抑制前列腺癌细胞LNCaP细胞增生和分泌MMP2，并促进其凋亡。高晓康［19］等用强力霉素处理PC3细胞，发现强力霉素可抑制PC3细胞的体外侵袭及MMP-2的表达。本研究发现：5、10、20mg/L的强力霉素以浓度依赖性抑制MMP-2蛋白表达，强力霉素浓度愈高，MMP-2蛋白表达愈弱。与之相对应，2.5mg/L以上的强力霉素可抑制人肺癌细胞系A549细胞对Matrigel的侵袭性，且随着药物浓度的增高，其抑制作用增强。与对照相比，2.5mg/L强力霉素的趋化抑制率为12.1%，5、10、20mg/L强力霉素的趋化抑制率分别为47.3%、71.4%、86.8%。表明强力霉素可以抑制A549细胞的体外侵袭力，该作用可能与其抑制MMP-2蛋白表达有关。
本实验还发现，10mg/L以上强力霉素可以抑制A549细胞生长，且呈显著的时间、剂量依赖关系，表明强力霉素不仅可以通过抑制MMP-2来抑制肺癌细胞的侵袭转移，而且可以通过抑制肿瘤细胞的增生直接参与肺癌的治疗。
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