【摘要】 ：目的 讨论肿瘤坏死因子α(TNF-α)和基质金属蛋白酶-3(MMP-3)在子宫内膜异位症(EMs)中的表达和发病的关系。方法 以EMs患者20例作研究组，分别取其术前清晨空腹静脉血3mL和在位与异位内膜，以子宫肌瘤患者20例的血清和内膜为对照组。内膜中的MMP-3采用免疫组化方法测定。血清中TNF-α和MMP-3的含量采用ELISA法检测。结果 MMP-3、 TNF-α在血清中的含量在实验组明显高于对照组(P＜0.01)。MMP-3主要定位于子宫内膜组织的间质细胞。在异位内膜中，其阳性染色强度均较强，以(+)～(++)为主，呈棕黄色或棕褐色，明显强于正常子宫内膜(P＜0.05)，差异有统计学意义。MMP-3在正常子宫内膜组中增殖期的表达强于分泌期(P＜0.05)。结论 MMP-3在EMs患者异位内膜和在位内膜中的高表达，促进了内膜的侵袭、浸润。TNF-α和MMP-3在EMs患者血清中的含量升高，在黏附的同时促进新生毛细血管的形成，加速了EMs的发生发展。
【关键词】 子宫内膜异位症;肿瘤坏死因子α;基质金属蛋白酶-3
Abstract：Objective To investigate the expression and significanceof the TNF-α and MMP-3 in patients with endometriosis (EMs). Methods 20 cases with EMs (research group ) and 20 cases with the uterine fibroid patients( control group) were selected. MMP-3 in endometrium was measured by immunohistochemistry method. Serum TNF-α and MMP-3 were measured by ELISA method. Results MMP-3 positioned mainly in the endometrial stromal cells of endometrium. The serum TNF-α and MMP-3 ，in research group were significantly higher than those in control group(P＜0.05).Expression of MMP-3 in normal endometrial proliferation was significantly stronger than that in secretory phase (P＜0.05). Conclusion High expression of MMP-3 in patients with EMs enhance and promote the transfer of the endometrium and infiltration.Rising of the serum TNF-α and MMP-3 promote new capillary formation and accelerated the development of EMs.
Key words：endometriosis; tumor necrosis factor-α; matrix metalloproteinase-3
子宫内膜异位症(简称内异症，EMs)，虽是良性疾病，但有恶性肿瘤远处转移和侵袭的特性，近年来更多的学者关注于EMs在位内膜的生物学特性，在位内膜在宫腔以外生长，能够降解ECM(细胞外基质)，并生成新的毛细血管。肿瘤坏死因子（TNF-α）能够促进VEGF（血管内皮生成因子）的生成，基质金属蛋白酶3(MMP-3)能降解ECM。本实验通过测定内异症患者血清中的TNF-α、MMP-3及异位和在位内膜中MMP-3的表达，探讨TNF-α与MMP-3在EMs发病机制中的相关性，为治疗EMs提供依据。
1 研究对象与方法
1.1 研究对象
选取2007年10月至2008年6月因子宫内膜异位症（卵巢型）在宁夏医科大学附属医院妇科行腹腔镜术或剖腹术的住院患者20例作为实验组，年龄23～46岁，平均39.26岁，取在位内膜和异位内膜灶，分为在位内膜组与异位内膜组。其中增殖期10例，分泌期10例。选取同期因子宫肌瘤切除子宫或单纯剔肌瘤患者的子宫内膜20例作为对照组，32～49岁，平均42.64岁，增殖期10例，分泌期10例。所取标本经中性福尔马林液固定后石蜡包埋，待用。同时抽取实验组和对照组患者术前清晨空腹静脉血3mL，自然凝固，台式离心仪2500转/min，5min分离血清，贮存于-80℃冰箱中，待测。研究对象术前3个月内均未用激素治疗，术后组织病理学检查证实为子宫内膜异位症和子宫平滑肌瘤。
1.2 方法
免疫组化染色检测MMP-3 组织石蜡块连续4μm厚切片，使用经多聚赖氨酸挂胶的干净玻片，捞片后置于烤箱中60℃过夜，取出，将切片脱蜡至水，使用3%h3O2消除内源性过氧化物酶活性后进行抗原修复，研究中采用链霉亲和素-生物素(SABC)法，一抗为武汉博士德生物公司提供的兔抗人MMP-3多克隆抗体（即用型），染色步骤参照说明书进行，用二氨基联苯胺(DAB)显色后，复染、脱水、透明、封片。用已知阳性乳腺癌切片作阳性对照;以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。每批实验均同时设立阳性对照与阴性对照。血清中MMP-3、 TNF-α含量的测定采用ELISA法，严格按试剂盒说明的实验步骤检测。
1.3 结果判定
子宫内膜腺体细胞胞浆中出现棕黄色或褐色颗粒为阳性。根据阳性细胞百分率及显色深浅分级。(1)阳性细胞百分率分级:无细胞显色或阳性细胞数＜5%为0；5%～35%细胞显色为1；36%～65%细胞显色为2；＞65%细胞显色为3；(2)显色深浅分级：不显色或显色不清为0；浅黄色为1；棕黄色为2；深褐色为3。将二者的评分相加除以2，作为该切片的最终评分：将0、0～1、1.5 ～3分分别定为阴性(-)、阳性(+)、强阳性(++)。
1.4 统计学方法
采用SPSS 11.5软件进行两样本秩和检验和t检验。
2 结果
2.1 两组患者血清中MMP-3、TNF-α含量变化
实验组患者血清中MMP-3、 TNF-α含量明显高于对照组(P＜0.01)，见表1。表1 实验组和对照组患者血清中MMP-3、 TNF-α的含量（略）
2.2 MMP-3在不同内膜组织中的表达
见表2。表2 MMP-3在实验组和对照组内膜中的表达（略）
MMP-3主要定位于子宫内膜腺体的间质细胞。实验组在位内膜（图1、2见封4）和异位内膜（图3，见封4）中，其阳性染色强度均较强，以(+)～(++)为主，呈棕黄色或棕褐色，阳性表达率明显强于对照组子宫内膜（图4、5，见封4），P＜0.05。MMP-3在对照组子宫内膜组中增殖期的表达强于分泌期，P＜0.05，见表3。表3 MMP-3在实验组和对照组在位内膜中的表达（略）
3 讨论
TNF-α是一类具有多种生物活性的细胞因子，是由激活的单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等产生的高效能的细胞因子，一方面是机体免疫保护的重要介质，另一方面可参与机体的免疫病理损伤［1］。本试验结果表明，EMs患者血清中的TNF-α的含量明显高于正常对照组，可能系腹腔液内存在大量的TNF-α入血所致，也可能与EMs患者外周血单核细胞活性增强，免疫防御功能受到破坏，导致机体的细胞因子调节系统紊乱， 过量的TNF-α不仅可以抑制IgG和IgM的产生，而且还影响某些克隆T细胞的分化，使T淋巴细胞不能发挥正常的免疫反应所致［2］。TNF-α通过介导炎症和免疫反应，使多种细胞产生多种细胞因子，促进子宫内膜间质细胞生长和分泌VEGF（血管内皮生成因子）。TNF-α可能诱导腹腔间皮细胞表达黏附分子，使内膜基质细胞黏附在腹腔间皮细胞，同时TNF-α通过促进子宫内膜间质细胞生长和分泌VEGF，使异位内膜基底部毛细血管的数量和面积增多，有利于内膜的种植、生长，向组织深部浸润。
EMs的形成是在位的子宫内膜随经血逆流至宫腔外，黏附并种植的过程。研究发现，MMPs除能降解ECM和BM(基底膜)外，还参与了血管的生长和内皮细胞的选择性扩张等活动，与细胞的侵袭性生长机制密切相关［3］。在众多的MMPs中，MMP-3显得尤为重要，它以酶原的形式释放，由纤溶酶激活，不仅能够降解ECM，更重要的是它能激活其他MMPs的酶原形式。本研究结果显示，EMs患者在位内膜的表达强于对照组子宫内膜，进一步佐证了“在位内膜决定论”，说明在位内膜的生物学特性的改变是EMs发生的源头。而异位内膜MMP-3表达明显强于对照组子宫内膜，认为MMP-3在EMs患者异位子宫内膜的过度表达可以促进逆流的子宫内膜组织碎片黏附到腹膜、卵巢表面，并降解ECM，导致早期异位病灶的形成。本实验还发现，MMP-3在对照组子宫内膜增殖期的表达高于分泌期的表达，而在内异症患者在位子宫内膜中的表达却无此差别，推测雌激素可能促进其分泌，而孕激素则抑制其分泌，与文献报道一致［4］，从而指导临床的药物治疗。
有研究发现TNF-α能够促进MMP-3的分泌，在TNF-α 0.1 ng/mL刺激浓度时细胞培养上清中MMP-3的浓度即明显升高，并随作用时间的延长和作用剂量的增加而不断升高［5］。本实验结果显示，EMs患者血清中的MMP-3和TNF-α同时升高，一方面TNF-α通过自身炎性细胞因子的作用加速EMs的发生发展， 诱导腹腔间皮细胞表达黏附分子，使内膜基质细胞黏附在腹腔间皮细胞，促进内膜间质细胞的生长和VEGF的分泌，另一方面，通过诱导MMP-3的分泌，增强异位内膜对ECM水解破坏和促进异位灶新生血管的形成，协同促进了EMs的发生发展。目前发现sTNFRⅠ（可溶性肿瘤坏死因子受体）作为TNF-α的拮抗剂，具有抑制TNF-α对其他细胞因子分泌的作用，TIMP(组织金属蛋白酶抑制物)可抑制MMP-3的活性。
参考文献
［1］何浩明.医学实验研究论文集［M］.北京:原子能出版社，1997:181.
［2］何飞，侯芳玉，徐进.肿瘤坏死因子与AIDS［J］.国外医学免疫学分册，1992， 15(4): 179.
［3］OsteenKG， Bruner-TranKL， Keller NR， et al. Progesterone- mediated endometrial maturation limits matrix metallo- pro-teinase (MMP) expression in an inflammatorg-like environment:a regulatory systEMs altered in endometriosis［J］.Ann NY Acad Sci，2002， 95 (5) :37-47.
［4］翦薇，何福仙. 肿瘤坏死因子α及孕酮对异位子宫内膜间质细胞分泌基质金属蛋白酶-3的调节 ［J］.现代妇产科进展，2004，(13): 410-412.
［5］钱如云，刘嘉茵.TNF-α及sTNFRⅠ对子宫内膜异位症在位内膜基质细胞的作用［J］.南京医科大学学报(自然科学版)，2008，28（5）：635-639.